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合成蛍光プローブを用いた蛋白質の蛍光標識技術は、蛍光蛋白質に代わる新しい蛍光イメージング技術として注目を集めている。我々は、β-ラクタマーゼ変異体（BLタグ）をタグ蛋白質として、その特異的蛍光プローブにより標的タンパク質を標識しイメージングする技術を開発してきた。本年度の研究では、光安定性の高い蛍光色素を組み込んだBLタグプローブを設計・開発し、細胞内蛋白質を1分子イメージングする方法を確立するとともに、蛋白質間相互作用の検出に関する研究への応用展開を行った。
まず、BLタグのリガンドの一つであるバカンピシリンに光退色に強いTAMRAを導入した蛍光プローブを設計した。このとき、色素とリガンドを水溶性リンカーであるエチレングリコール（EG）で繋いだ。異なる長さのEGリンカーを持つプローブを合成し、核に局在させたBLタグの生細胞イメージングを行ったところ、一つのEGをリンカーとしたプローブが細胞膜透過性や、細胞内蛋白質の標識特異性の観点から最適であることが判明した。次に、このプローブを用いて、細胞内膜に局在させたBLタグを全反射照明蛍光顕微鏡にて観察したところ、1分子蛍光に基づく複数の蛍光輝点が観測された。このことから、BLタグと新規プローブを用いることにより、細胞膜近傍に存在する蛋白質を1分子観察することができることが示された。次に、炎症・免疫に関わる受容体TLR4及びTLR4の細胞内ドメインに結合するTIRAPを1分子解析した。このとき、HaloタグとBLタグとそれぞれのプローブを用いることで、同時に2つの蛋白質を1分子解析することが可能となった。TLR4をLPSで刺激し1分子蛍光観察したところ、拡散速度の遅い成分がそれぞれの蛋白質由来の蛍光輝点の解析から分かった。このことは、これらの蛋白質が相互作用した結果、運動性が低下したと考えられる。
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