研究領域 | 少数性生物学―個と多数の狭間が織りなす生命現象の探求― |
研究課題/領域番号 |
24115508
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研究機関 | 名古屋工業大学 |
研究代表者 |
井上 圭一 名古屋工業大学, 工学(系)研究科(研究院), 助教 (90467001)
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研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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キーワード | 一分子観察 / ロドプシン / Cheタンパク質 |
研究実績の概要 |
研究計画初年度の当たる平成24年度はセンサリーロドプシンI、トランスデューサータンパク質、Cheタンパク質の間の信号伝達過程の一分子観察のための全反射顕微鏡観測系の構築を主として行った。 そのためにまず浜松ホトニクス社製のデュアルCCDカメラを導入し、それを用いて、蛍光色素によって染色されたロドプシンの一分子観察を試みた。この時観察光による不必要なロドプシンの光励起を避けるため、ロドプシンよりも長波長に吸収を持つDyLight650色素を観察に用いた。そしてDyLight650を結合させるため、システイン残基を導入したロドプシンを再構成し、スライドガラス上に固定し観察を試みたところ、一分子からの蛍光を得ることに成功した。従って観察系の構築は研究計画通り完了したため、今後はこれを用いた信号伝達過程の一分子観察を行っていく。 一方センサリーロドプシンIとトランスデューサーを脂質二重膜に再構成した条件で両分子間の相互作用が正常に行われている事を確認するため、過渡吸収測定を行った。本来センサリーロドプシンIのみの場合は光反応サイクルの速度がpHに依存し、高pH側で速度が遅くなることが知られている。それに対し生体内でトランスデューサーと複合体を形成した場合はpH依存性が無くなり、常に同じサイクル速度を示す事が分かっている。そこで今回独立に発現させたセンサリーロドプシンIとトランスデューサーを1:1の割合で混合し、光反応サイクルの観測を行ったところ、まだフォトサイクルのpH依存性が見られた。このことから今後再構成系で相互作用過程を観察する際には過剰量のトランスデューサーを加える必要がある事が明らかになった。 本年度においては2件の論文発表の他、22件の学会発表を行った。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は一分子観察用の顕微鏡の構築を完了し、それを用いた色素染色されたロドプシンの一分子観察にも成功した。またセンサリーロドプシンIおよびトランスデューサーの発言系の構築も完了し、今後は相互作用する条件検討を行った後、実際に信号伝達過程の観測を行う。
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今後の研究の推進方策 |
最終年度に当たる平成25年度はセンサリーロドプシンIやトランスデューサー、Cheタンパク質にラベリング用のシステインを導入した変異体を作製し、その間のFRET観察を行うことで、信号伝達過程の解明を目指す。
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備考 |
本研究の成果について3件の新聞報道が行われたことをここに特記する。
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