| 研究領域 | 非コードＲＮＡ作用マシナリー |
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| 研究課題/領域番号 |
24115703
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| 研究機関 | 高知大学 |
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研究代表者 |
清澤 秀孔 高知大学, 医学部, 特任准教授 (30295422)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| キーワード | ゲノム刷り込み / アンチセンスRNA / 非コードRNA / RNA-seq / MSM/Ms / ES細胞 |
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| 研究実績の概要 |
Ube3a遺伝子座のアンチセンスRNAの転写単位同定の第一歩として次世代シーケンサーを用いてRNA-seqを行った。サンプルは独自に樹立した遺伝的多型を有するES細胞（C57BL/6とMSM/Ms間のF1亜種間雑種ES細胞：C57BL/6が父親、MSM/Msが母親の組み合わせ）をin vitroで神経細胞へ分化させたものを用いた。Ube3a遺伝子は神経細胞では母親由来の染色体からのみ発現し、Ube3aアンチセンスRNAは父親由来の染色体からのみ発現することが知られている。C57BL/6とMSM/Ms間のSNPsを利用することにより、RNAの染色体の由来を区別することができる。また最新のstrand-sensitiveなcDNA作製試薬を用いることにより、転写産物の鎖特異性の区別を行った。
in vitro分化系で誘導した神経細胞ではRNA-seqの結果、Ube3a遺伝子はほとんどが母親由来の染色体から転写されたものであり、Ube3aアンチセンスRNAは父親由来の染色体から転写されたものが優勢であった。更にcDNA作製時にoligo dTプライミングを行わないことによりポリA鎖を持たないRNAを用いて配列解析を行ったところ、Ube3aアンチセンスRNAのほとんどがポリA鎖を持たないRNAとして細胞内で存在していることが判明した。また、アンチセンスRNA自体は（イントロンを含む）Ube3a遺伝子座全体に渡って存在しており、Ube3a遺伝子座の下流領域からsteady-stateで蓄積していることが観察された。すなわち見かけ上はUbe3a遺伝子座の少し下流から転写が始まっているように見える。
次世代シーケンサー（イルミナHiseq2000）による配列解析では配列決定はペアエンドで行っているため、現在、ペアエンド間でゲノム上の距離の離れた配列やイントロンを含む配列の存在を解析中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Ube3aアンチセンスRNAの転写単位を同定する為の方法としては次世代シーケンサーによるものしか行えていないが、転写単位をより正確に決めるためにはPolIIのChIP解析が有効であると考え、in vitro分化系においてちょうどUbe3aアンチセンス転写が始まる時期において検討中である。
また、ゲノム刷り込み研究において亜種間雑種F1個体の遺伝的多型を用いた解析ではF1固体の親の組み合わせを変えても同様の結果を得ることが必要な条件となっている。計画では25年度において（昨年度用いたES細胞とは逆の親の組み合わせである）C57BL/6が母親、MSM/Msが父親由来のES細胞を樹立し、更にはin vitroにおける神経細胞への分化系の確立を行い、実験の再現性を検討する予定であったが、24年度中にC57BL/6が母親、MSM/Msが父親由来の新しいES細胞を樹立し、in vitroにおけるUbe3a遺伝子のゲノム刷り込みを確認した。現在、このサンプルもRNA-seq解析中である。
以上のように遅れている部分と進んでいる部分があり、おおむね順調である。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在、Ube3aアンチセンスRNAが存在している領域から候補を選び、アンチセンスRNAのノックダウンコンストラクトを作成中である。主にUbe3a遺伝子座の反対鎖領域、及び少し下流領域から選んでいる。アンチセンスRNAが発現を開始するのはin vitro分化系においては神経細胞前駆体が神経突起を伸長させる時期と一致している。薬剤添加による発現制御されたshRNA発現ベクターをES細胞に組み込み、アンチセンスRNAが上昇する時期にノックダウンを試み、Ube3a遺伝子の組織特異的ゲノム刷り込みへの影響を解析する。また、同時期からのサンプルでPolIIのChIP解析を行うことによりアンチセンスRNAのプロモーター領域の同定を試みたい。
Ube3aアンチセンスRNAはUbe3a遺伝子座から数百Kbも下流であるSnurf/Snrpn遺伝子座領域から転写されているとの報告もあるので、RNA-seqの配列データのペアエンド配列を詳細に解析することにより、実際にアンチセンスRNAがそのような距離が離れたところから転写されている証拠となるペアエンドが存在するかなどを含めた詳細な配列解析を行う。
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