公募研究
独自の無細胞翻訳系を様々な哺乳類の細胞を用いて構築し、翻訳過程、特に翻訳開始過程を詳細に検証できる系の構築を行った。具体的には既に構築済みのluciferase mRNAにmicroRNAの標的配列を付加したレポーターRNAを用いて、microRNAの存在下および非存在下でのレポーターの発現を無細胞翻訳系で検証した。microRNAはmiR-1を用いた。さらに、λファージのNタンパク質に由来するペプチドをGSTと融合し、Nタンパク質によって認識される15ヌクレオチドのヘアピン型RNAであるBoxB配列を、レポーターmRNAの3’非翻訳領域に挿入したmRNAを構築し、このmRNAを用いたin vitro翻訳系においてGST融合Nタンパク質を用いたGST-pull down実験によりmRNP pull-down実験を実施した。この系において、cap構造の違いやmicroRNA存在下および非存在下におけるmRNP上の構成成分を詳細に解析した。その結果、microRNA存在下および非存在下におけるmRNP構成の重要な違いを発見した。
2: おおむね順調に進展している
これまでに、HeLa細胞抽出物を用いた無細胞翻訳系では判定が難しかったmiRNAによる翻訳制御を観察する系が、別の細胞を用いることで劇的に進展した。また、その結果、遂行が困難であると思われたmRNA-pull dwonによる構成成分の違いを明確に判定することが可能になった。
研究計画通りに進行している。今後、翻訳開始機構に対するmiRNAマシナリーの抑制効果と、翻訳開始を活性化させる翻訳開始因子のリン酸化、そして申請者がこれまで研究していたHuDをはじめとするRNA結合タンパク質が、翻訳開始複合体形成時にお互いどのように影響をおよぼすかを検証する。具体的には、in vitro翻訳系における競合をレポーター遺伝子の発現を指標に検証し、そのときに形成される翻訳開始複合体およびポリソーム画分に含まれる因子を詳細に解析する。
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