マルチ翻訳後修飾プロテオミクスによる代謝・転写システムの大規模解析

2012 年度 実績報告書

• 研究領域: 生命素子による転写環境とエネルギー代謝のクロストーク制御
• 研究課題/領域番号: 24116513
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 石濱 泰 京都大学, 薬学研究科(研究院), 教授 (30439244)
• 研究期間 (年度): 2012-04-01 – 2014-03-31
• キーワード: 翻訳後修飾 / プロテオーム / 代謝 / 転写因子

研究実績の概要

独自のリン酸化プロテオーム解析システムにアセチル化等の修飾を加えたマルチ翻訳後修飾プロテオーム計測システムを確立する。転写制御タンパク群および代謝酵素群にフォーカスした試料前処理法の開発と併せ、代謝および転写システムをマルチ翻訳後修飾の観点から俯瞰する大規模計測システムを確立し、既知情報にとらわれない不偏的マルチ翻訳後修飾発見研究を行い、代謝および転写システムにおける翻訳後修飾タンパク質の分子基盤を明らかにすることを目的とする。初年度は、計画通り、測定プラットフォームの確立を中心に行った。リン酸化については、チロシンリン酸化に焦点をあてた新たな濃縮方法の検討を行い、化学反応を利用する方法および化学的濃縮と抗体による濃縮を組み合わせた方法を確立した。マウス10臓器に対して大規模解析を行い、1200種のチロシンリン酸化サイトを含む約20000種のリン酸化サイトを同定することに成功した。更に一般的にリン酸化タンパク質含量の低いバクテリアのリン酸化プロテオミクスのための前処理法の検討を行い、現法の約10倍濃縮効率を高めた方法を確立した。大腸菌に適用したところ、約1000種のユニークリン酸化ペプチドを同定することができた。アセチル化について、従来より報告のあった抗体による濃縮法に加え、化学反応を組み合わせた方法をほぼ確立した。　これにより濃縮抗体の有するバイアスを除去可能となり、より幅広いアセチローム解析が可能となった。モノリスカラムを用いたLC-MS分析系を最適化し、ヒトiPS細胞プロテオーム解析（線維芽細胞を参照試料に設定）に適用したところ、約9500タンパク質をプロファイルすることに成功した。詳細にデータを解析した結果、今までにタンパク質として検出されたことがなく、しかもiPS細胞に選択的に発現が認められた転写因子が５種含まれていることが明らかとなった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

初年度に計画していた研究項目は、リン酸化、アセチル化（抗体法、化学法）、メチル化、試料前処理法および深化LC-MSである。このうち、リン酸化は期待以上の成果があがっており、またアセチル化についても抗体法、化学法とも目途がたった。メチル化については遅れているが、バクテリアに対する試料前処理法、深化LC-MS法も着実に進展しているため。

今後の研究の推進方策

前年度に引き続き、手法の最適化をはかりながら、大規模解析を始める。iPS細胞については、転写因子に的を絞った解析を行うとともに、リン酸化、アセチル化の大規模解析を行い、転写・代謝におけるクロストーク制御について検討を行う。また、バクテリアについては、特に代謝に焦点を絞り、リン酸化およびアセチル化がおよぼす影響を定量的に解析する計画である。メチル化については、方法が確立次第、上記の大規模解析に組み入れる。

研究成果

• [雑誌論文] In-depth Membrane Proteomic Study of Breast Cancer Tissues for the Generation of a Chromosome-based Protein List. (2013)
  • 著者名/発表者名: Muraoka S, Kume H, Adachi J, Shiromizu T, Watanabe S, Masuda T, Ishihama Y, Tomonaga T.
  • 雑誌名: J Proteome Res 巻: 12(1) ページ: 208-13
  • DOI: DOI: 10.1021/pr300824m
• [雑誌論文] Rapid and Deep Profiling of Human Induced Pluripotent Stem Cell Proteome by One-shot NanoLC－MS/MS Analysis with Meter-scale Monolithic Silica Columns (2013)
  • 著者名/発表者名: Yamana R, Iwasaki M, Wakabayashi M, Nakagawa M, Yamanaka S, Ishihama Y.
  • 雑誌名: J Proteome Res 巻: 12(1) ページ: 214-21
  • DOI: DOI: 10.1021/pr300837u
• [雑誌論文] Metabolomic profiling of lung and prostate tumor tissues by capillary electrophoresis time-of-flight mass spectrometry (2013)
  • 著者名/発表者名: Kami K, Fujimori T, Sato H, Sato M, Yamamoto H, Ohashi Y, Sugiyama N, Ishihama Y, Onozuka H, Ochiai A, Esumi H, Soga T, Tomita M.
  • 雑誌名: Metabolomics 巻: 9(2) ページ: 444-53
  • DOI: DOI 10.1007/s11306-012-0452-2
• [雑誌論文] Global microRNA elevation by inducible Exportin 5 regulates cell cycle entry. (2013)
  • 著者名/発表者名: Iwasaki YW, Kiga K, Kayo H, Fukuda-Yuzawa Y, Weise J, Inada T, Tomita M, Ishihama Y, Fukao T.
  • 雑誌名: RNA 巻: 19(4) ページ: 490-7
  • DOI: doi: 0.1261/rna.036608.112.
• [雑誌論文] LATS1/WARTS phosphorylates Myosin Phosphatase-Targeting Subunit 1 to counteract Polo-like Kinase 1 (2012)
  • 著者名/発表者名: Chiyoda T, Sugiyama N, Shimizu T, Naoe H, Kobayashi Y, Ishizawa J, Arima Y, Tsuda H, Ito M, Kaibuchi K, Aoki D, Ishihama Y, Saya H, Kuninaka S.
  • 雑誌名: J Cell Biol. 巻: 197(5) ページ: 625-41
  • DOI: doi: 10.1083/jcb.201110110
• [雑誌論文] Short-chain fatty acid receptor GPR41-mediated activation of sympathetic neurons involves synapsin 2b phosphorylation. (2012)
  • 著者名/発表者名: Inoue D, Kimura I, Wakabayashi M, Tsumoto H, Ozawa K, Hara T, Takei Y, Hirasawa A, Ishihama Y, Tsujimoto G.
  • 雑誌名: FEBS Lett. 巻: 586(10) ページ: 1547-54
  • DOI: doi: 10.1016/j.febslet.2012.04.021,
• [雑誌論文] Analytical strategies for shotgun phosphoproteomics: Status and prospects. (2012)
  • 著者名/発表者名: Imamura H, Wakabayashi M, Ishihama Y.
  • 雑誌名: Semin Cell Dev Biol. 巻: 23(8) ページ: 836-42
  • DOI: doi: 10.1016/j.semcdb.2012.05.007
• [雑誌論文] Construction of a Microscale Phosphoproteomics System with High Sensitivity (2012)
  • 著者名/発表者名: Masuda T, Ishihama Y
  • 雑誌名: BUNSEKI KAGAKU 巻: 61(6) ページ: 459-67
  • DOI: doi: 10.2116/bunsekikagaku.61.459
• [雑誌論文] Mass spectrum sequential subtraction speeds up searching large peptide MS/MS spectra datasets against large nucleotide databases for proteogenomics. (2012)
  • 著者名/発表者名: Helmy M, Sugiyama N, Tomita M, Ishihama Y.
  • 雑誌名: Genes Cells. 巻: 17(8) ページ: 633-44
  • DOI: doi: 10.1111/j.1365-2443.2012.01615.x
• [雑誌論文] Nestin Protein Is Phosphorylated in Adult Neural Stem/Progenitor Cells and Not Endothelial Progenitor Cells (2012)
  • 著者名/発表者名: Namiki J, Suzuki S, Masuda T, Ishihama Y, Okano H.
  • 雑誌名: Stem Cells International 巻: 2012 ページ: 430138
  • DOI: doi:10.1155/2012/430138
• [雑誌論文] Temporal profiling of lapatinib-suppressed phosphorylation signals in EGFR/HER2 pathways. (2012)
  • 著者名/発表者名: Imami K, Sugiyama N, Imamura H, Wakabayashi M, Tomita M, Taniguchi M, Ueno T, Toi M, Ishihama Y.
  • 雑誌名: Mol Cell Proteomics 巻: 11(12) ページ: 1741-57
  • DOI: doi: 10.1074/mcp.M112.019919
• [雑誌論文] Phosphoproteomic Analysis of Rhodopseudomonas palustris Reveals the Role of Pyruvate Phosphate Dikinase Phosphorylation in Lipid Production. (2012)
  • 著者名/発表者名: Hu CW, Lin MH, Huang HC, Ku WC, Yi TH, Tsai CF, Chen YJ, Sugiyama N, Ishihama Y, Juan HF, Wu SH
  • 雑誌名: J Proteome Res 巻: 11 ページ: 5362-75
  • DOI: DOI: 10.1021/pr300582p
• [雑誌論文] PINK1-mediated phosphorylation of the Parkin ubiquitin-like domain primes mitochondrial translocation of Parkin and regulates mitophagy. (2012)
  • 著者名/発表者名: Shiba-Fukushima K, Imai Y, Yoshida S, Ishihama Y, Kanao T, Sato S, Hattori N.
  • 雑誌名: Sci Rep. 巻: 2 ページ: 1002
  • DOI: doi: 10.1038/srep01002.
• [学会発表] 定量的リン酸化プロテオミクスを用いた分子標的薬プロファイリング (2013)
  • 著者名/発表者名: 林侑生; 市原駿; 小椋麻由; 吉田繁治; 若林真樹; 杉山直幸; 石濱泰
  • 学会等名: 日本薬学会第133年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川）
  • 年月日: 2013-03-27 – 2013-03-30
• [学会発表] リン酸化プロテオミクスを用いた細胞内リン酸化ネットワークの解明 (2013)
  • 著者名/発表者名: 石濱泰
  • 学会等名: 日本薬学会第133年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川）
  • 年月日: 2013-03-27 – 2013-03-30
• [学会発表] メートル長シリカモノリスカラムを用いたヒトプロテオームLC-MS解析 (2013)
  • 著者名/発表者名: 市原駿, 山本有希子, 山名涼太, 岩崎未央, 若林真樹, 石濱泰
  • 学会等名: 日本薬学会第133年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川）
  • 年月日: 2013-03-27 – 2013-03-30
• [学会発表] Illuminating human complete proteome by in-depth proteogenomics approaches (2013)
  • 著者名/発表者名: Y. Ishihama
  • 学会等名: 2013 PGM21-KSBMB joint symposium on multi-omics in medicine
  • 発表場所: High1 resort (韓国）
  • 年月日: 2013-01-15 – 2013-01-16
• [学会発表] プロテインキナーゼの基質認識要素に関わる計算的および実験的プロファイリング (2012)
  • 著者名/発表者名: 今村春菜, 杉山直幸, 若林真樹, 石濱泰
  • 学会等名: 第85回日本生化学会大会
  • 発表場所: 福岡国際会議場（福岡）
  • 年月日: 2012-12-14 – 2012-12-16
• [学会発表] 化学的チロシンリン酸化ペプチド濃縮法の開発とリン酸化プロテオーム変動解析への応用 (2012)
  • 著者名/発表者名: 吉田繁治, 辜韋智, 杉山直幸, 若林真樹, 中野実, 石濱泰
  • 学会等名: 第85回日本生化学会大会
  • 発表場所: 福岡国際会議場（福岡）
  • 年月日: 2012-12-14 – 2012-12-16
• [学会発表] 高深化する細胞内リン酸化ネットワーク (2012)
  • 著者名/発表者名: 石濱泰
  • 学会等名: 第85回日本生化学会大会
  • 発表場所: 福岡国際会議場（福岡）
  • 年月日: 2012-12-14 – 2012-12-16
• [学会発表] Illuminating Cellular Phosphorylation Network through Quantitative Phosphoproteomics (2012)
  • 著者名/発表者名: Y. Ishihama
  • 学会等名: IPR International Symposium 2012#8211;Toward the Molecular Comprehension of Life System
  • 発表場所: 千里阪急ホテル（大阪）
  • 年月日: 2012-11-22 – 2012-11-22
• [学会発表] メートル長モノリスシリカカラムを用いたヒトiPS細胞プロテオーム解析 (2012)
  • 著者名/発表者名: 山名涼太, 岩崎未央, 若林真樹, 中川誠人, 山中伸弥, 石濱泰
  • 学会等名: 第32回キャピラリー電気泳動シンポジウム
  • 発表場所: 産業技術総合研究所関西センター（大阪）
  • 年月日: 2012-11-07 – 2012-11-09
• [学会発表] Ultra High Resolution Chromatography to Extend Phosphoproteome World (2012)
  • 著者名/発表者名: Y. Ishihama
  • 学会等名: 28th International Symposium on MicroScale Bioseparations and Analyses (MSB2012)
  • 発表場所: Renaissance Shanghai Pudong Hotel (Shanghai, China)
  • 年月日: 2012-10-21 – 2012-10-24
• [学会発表] Profiling of Human Kinome using in vitro Kinase Assay in combinatino with Quantitative Phosphoproteomics (2012)
  • 著者名/発表者名: N. Sugiyama, M. Gouda, H. Imamura, M. Tomita, Y. Ishihama
  • 学会等名: 19th International Mass Spectrometry Conference
  • 発表場所: 京都国際会館（京都）
  • 年月日: 2012-09-15 – 2012-09-21
• [学会発表] Pyruvate Phosphate Dikinase Phosphorylation Increases Lipid Production in Rhodopseudomonas palustris: a Phosphoproteomic Analysis (2012)
  • 著者名/発表者名: C.-W. Hu, M.-H. Lin, T.-H. Yi, H.-C. Huang, W.-C. Ku, C.-F. Tsai, Y.-J. Chen, N. Sugiyama, Y. Ishihama, H.-F. Juan, S.-H. Wu
  • 学会等名: 19th International Mass Spectrometry Conference
  • 発表場所: 京都国際会館（京都）
  • 年月日: 2012-09-15 – 2012-09-21
• [学会発表] In-depth human proteome analysis by one-shot LC-MS/MS with meter-scale monolithic silica capillary columns (2012)
  • 著者名/発表者名: Iwasaki, M.; Wakabayashi, M.; Sugiyama, N.; Tanaka, N.; Ishihama, Y.
  • 学会等名: 19th International Mass Spectrometry Conference
  • 発表場所: 京都国際会館（京都）
  • 年月日: 2012-09-15 – 2012-09-21
• [学会発表] Toward complete coverage of human proteome by one-shot LC-MS/MS with meter-scale monolithic silica capillary columns (2012)
  • 著者名/発表者名: Iwasaki, M.; Wakabayashi, M.; Sugiyama, N.; Tanaka, M.; Ishihama, Y.
  • 学会等名: HUPO 11th Annual World Congress
  • 発表場所: Hynes Convention Center (Boston, USA)
  • 年月日: 2012-09-09 – 2012-09-14
• [学会発表] A Phosphoproteomics Survey of Protein Kinase Specificity with in vitro Kinase Assay (2012)
  • 著者名/発表者名: Imamura, H.; Wakabayashi, M.; Sugiyama, N.; Ishihama, Y
  • 学会等名: HUPO 11th Annual World Congress
  • 発表場所: Hynes Convention Center (Boston, USA)
  • 年月日: 2012-09-09 – 2012-09-14
• [学会発表] メートル長モノリス型シリカカラムを用いたヒトiPS細胞プロテオームの発現プロファイル解析 (2012)
  • 著者名/発表者名: 山名涼太; 岩崎未央; 若林真樹; 中川誠人; 山中伸弥; 石濱泰
  • 学会等名: 第25回バイオメディカル分析科学シンポジウム
  • 発表場所: 慶應義塾大学薬学部（東京）
  • 年月日: 2012-08-08 – 2012-08-10
• [学会発表] 拡がる細胞内リン酸化ワールド (2012)
  • 著者名/発表者名: 石濱泰
  • 学会等名: 第10回次世代を担う若手のためのフィジカル・ファーマフォーラム
  • 発表場所: ホテル平安の森京都（京都）
  • 年月日: 2012-08-06 – 2012-08-07
• [学会発表] 化学選択的濃縮法を用いるリン酸化チロシンを標的としたプロテオーム解析 (2012)
  • 著者名/発表者名: 吉田繁治; 辜韋智; 杉山直幸; 若林真樹; 中野実; 石濱泰
  • 学会等名: 日本プロテオーム学会2012年会
  • 発表場所: 日本科学未来館(東京)
  • 年月日: 2012-07-26 – 2012-07-27
• [学会発表] LC-MS/MSによるプロテインキナーゼ-基質認識因子の検証 (2012)
  • 著者名/発表者名: 今村春菜; 杉山直幸; 若林真樹; 石濱泰
  • 学会等名: 日本プロテオーム学会2012年会
  • 発表場所: 日本科学未来館(東京)
  • 年月日: 2012-07-26 – 2012-07-27