| 研究領域 | 内因性リガンドによって誘導される「自然炎症」の分子基盤とその破綻 |
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| 研究課題/領域番号 |
24117712
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
川畑 俊一郎 九州大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (90183037)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| キーワード | 自然炎症 / ショウジョウバエ / 腸管免疫 / 腸内細菌叢 / トランスグルタミナーゼ / 架橋酵素 / 自然免疫 / 抗菌ペプチド |
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| 研究実績の概要 |
トランスグルタミナーゼ (TG) は、タンパク質の架橋反応を触媒する酵素である。最近、キイロショウジョウバエTGのRNAi実験により、TGは腸管免疫の制御に関与していることが示唆された。腸管免疫制御の分子機構は未解決の問題である。そこで、本研究では腸管免疫におけるTGの機能を調べた。TGをRNAiした系統と、コントロール系統の、腸管における各種免疫関連因子の産生量をリアルタイムPCR法により定量化した。その結果、主要な免疫経路であるIMD経路の抗菌ペプチドが、RNAi系統において著しく亢進していることが判明した。また、腸管特異的にTGをRNAiした系統では、コントロール系統と比較して生存率が有意に減少した。興味深いことに、RNAi系統を無菌状態にすると、生存率は大幅に回復した。さらに、TGのRNAi系統の腸管抽出物を、無菌化した野生型系統に経口投与すると、TGをRNAiしたときと同様に生存率が低下した。以上より、TGは腸管免疫を負に制御し、腸内細菌叢の維持を行っている可能性が高い。また、TGの合成基質を用いてIMD経路の基質タンパク質を同定した。この基質タンパク質とTGを昆虫細胞により共発現させたところ、基質タンパク質はTGにより高度に架橋された。以上のことから、TGはIMD経路の因子を架橋して不活性化させ、腸管免疫の恒常性維持に寄与していることが判明した。また、腸管では Peritropic membrane (PM)が、腸内細菌と腸管上皮を隔てるフィルターの役割を果たす。サイズの異なる蛍光標識dextranを野生型とTGノックダウンのハエに与えたところ、dextranのPM透過性が促進していることが判明し、TGによるタンパク質架橋反応がPM形成に重要な働きをしていることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
今年度は、下記に示す項目に関する研究を遂行し、すべてに関してデータを得て現在、原著論文を投稿中であり、当初計画を十分に達成できたと考える。
１）GAL4/UASシステムを用い、腸管特異的にdTGをRNAiによりノックダウンした。腸管からmRNAを回収し、リアルタイムPCR法によって、腸管におけるImd経路、およびToll経路依存的な各種抗菌ペプチド（セクロピン、ドロソマイシン、ジプテリシンなど）の発現量を定量化した。dTGをノックダウンあるいは過剰発現した系統と野生型の抗菌ペプチドの発現量をそれぞれ比較した。２）TGの合成基質であるペンチルアミン（ビオチン化）と腸管抽出液を混合し、dTG活性により抽出液中のタンパク質を特異的にビオチン化し、アビジン-磁気ビーズで回収後、質量分析することで、dTGの標的基質が転写因子Relishであることを同定した。３）同定した標的基質の組換えタンパク質を調製して、dTGによる架橋反応を生化学的に解析するとともに、標的基質の架橋部位がＮ末端部位に局在していることを同定した。さらに、標的基質に対する抗体を作製して、標的基質の腸管上皮における細胞内局在性を調べた。腸内細菌の有無による標的基質の細胞内局在性の変化も調べた。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、以下の項目について研究推進する予定である。
dTGノックダウンがおよぼす腸内細菌叢への影響を解明する。１）dTG-RNAiハエでは、野生型とは異なる腸内細菌叢を有していると推定される。dTG-RNAiハエと野生型ハエの腸管からDNAを抽出し、細菌の16S rRNAの保存領域に対応するPCRプライマーを用いてDNAを増幅し、その塩基配列を解析する。２）上記１）の結果をもとに、dTG-RNAiハエに特異的な腸管の細菌群を同定する。それらの細菌群が短命の原因となる可能性があるため、野生型の無菌バエに同定した細菌を感染させて、生存日数をコントロールのハエと比較する。経口感染やPAMPs投与による抗菌ペプチド発現量を解析する。１）野生型ハエ、およびdTG-RNAiハエに対して常在細菌や病原細菌を経口感染させて、リアルタイムPCR法によって腸管における各種抗菌ペプチドの発現量の変化を経時的に調べる。２）同様の実験を、細菌由来の種々のPAMPsを経口投与して行い、dTGによる生存率低下の原因を明らかにするとともに、腸管の恒常性維持の分子機構を解明する。腸管の新規のPAMPs受容体を同定する。１）腸管内には、PGRP-LCやPGRP-LE以外の未知のPAMPs受容体が存在する可能性がある。そこで、ビオチンラベルした各種PAMPsを経口摂取させ、腸管抽出液からアビジンビーズを用いてラベル化タンパク質を回収し、質量分析により同定する。
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