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2012 年度 実績報告書

TLRシグナルはBtkを介してNLRP3インフラマゾームの活性化を制御するのか?

公募研究

研究領域内因性リガンドによって誘導される「自然炎症」の分子基盤とその破綻
研究課題/領域番号 24117718
研究機関慶應義塾大学

研究代表者

森田 林平  慶應義塾大学, 医学部, 講師 (00362541)

研究期間 (年度) 2012-04-01 – 2014-03-31
キーワード免疫学 / サイトカイン
研究実績の概要

マウス腹腔マクロファ-ジ及びヒト単球性白血病細胞株THP-1をPMAにより分化させたマクロファ-ジ (THP-1-Mac) 何れにおいてもAlumで誘導されたIL-1b p17とcaspase-1 p20がBtk特異的阻害剤であるLFM-A13で抑制されることを確認している。更に poly (dA:dT) で誘導されるAIM2 inflammasome活性に対してはこのような効果が認められないことより、BtkはNLRP3 inflammasome特異的に関与することが示唆された。Btkの関与をより明確にするためにBtk変異マウスXid由来のマクロファージをAlumで刺激すると、野生型由来マクロファージに比べて、IL-1bの産生及びCaspase-1の活性化の優位な低下を認めた。THP-1マクロファージに対してBtk shRNAによるBtkのノックダウンを行ったところ、同様な結果が得られた。
更にXidの腹腔内にAlumを注射し腹膜炎を誘発させたところ、腹腔内の侵潤好中球数は野生型に比べてBtk変異マウスXidで優位に低下していた。これらの結果はBtkがNLRP3 inflammasomeの活性化を制御していることを示す。
過去にTLRのシグナルがBtkの活性化を誘導することが報告されており、本研究の成果と併せ考えると、Btkはシグナル1をシグナル2の橋渡しをするシグナル分子である可能性が深まった。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

BtkのNLRP3 inflammasome活性化への影響を分子レベルで解析する点ではベクター作成等の準備段階に留まっているが、Btk shRNAを用いたBtkノックダウンの実験及びマウスを用いた個体レベルでのBtkの重要性を確認できた点では、一つの目的を達成したと考える。

今後の研究の推進方策

本年度は主として、BtkのNLRP3 inflammasomeの制御機構を分子レベルで解析する。特にNLRP3のリン酸化に着眼する。
Btkの野生型、ドメイン欠損体そしてE41K-BtkをNLRP3と共にHEK293Tに強制発現させNLRP3の免疫沈降を行い、リン酸化チロシン特異的抗体4G10を用いたウェスタンブロット解析によりNLRP3のチロシンリン酸化を証明する。Btkは223と551番目のチロシンのリン酸化により活性化すると考えられておりこれらのアラニン置換の発現ベクタ-も合わせて作成し、NLRP3と共にHEK293Tに強制発現させた際のNLRP3のチロシンリン酸化の有無を調べる。尚Btk shRNAを安定発現したTHP-1-M#61542;をNLRP3あるいはASC抗体により免疫沈降を行い、4G10にて内在性のNLRP3のチロシンリン酸化も明らかにする。更に、NLRP3のリン酸化が証明された場合、GST融合NLRP3をBtkと共にHEK293Tに発現させグルタチオンカラムによりGST融合NLRP3を精製する。精製NLRP3をトリプシン処理しMS/MS解析によりリン酸化部位を同定する。尚、BtkがNLRP3をリン酸化するにはinflammasomeを形成する細胞内環境が必要である可能性がある。その場合はAlum刺激THP-1-M#61542;の細胞溶解液をSDSゲル電気泳動にかけ、NLRP3のバンドを切り出しゲル内消化によりペプチドサンプルを得る。

  • 研究成果

    (3件)

すべて 2012

すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件) 学会発表 (1件)

  • [雑誌論文] Peroxiredoxin family proteins are key initiators of post-ischemic inflammation in the brain.2012

    • 著者名/発表者名
      Shichita Takashi
    • 雑誌名

      Nat Med

      巻: 18 ページ: 911-917

    • DOI

      doi: 10.1038/nm.2749

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Smad2 and Smad3 are redundantly essential for the suppression of iNOS synthesis in macrophages by regulating IRF3 and STAT1 pathways.2012

    • 著者名/発表者名
      Sugiyama Yuki
    • 雑誌名

      Int Immunol

      巻: 24 ページ: 253-265

    • DOI

      doi: 10.1093/intimm/dxr126

    • 査読あり
  • [学会発表] Btk modulates NLRP3, but not AIM2, inflammasome activation2012

    • 著者名/発表者名
      Morita Rimpei
    • 学会等名
      International Endotoxin and Innate Immunity Society Meeting 2012
    • 発表場所
      Tokyo
    • 年月日
      2012-10-23 – 2012-10-26

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公開日: 2018-02-02  

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