大腸菌バーコード欠失株による化合物-遺伝子相互作用Multiplex解析

2014 年度 実績報告書

• 研究領域: 生合成マシナリー：生物活性物質構造多様性創出システムの解明と制御
• 研究課題/領域番号: 25108716
• 研究機関: 奈良先端科学技術大学院大学
• 研究代表者: 森 浩禎 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 教授 (90182203)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: 分子バーコード欠失株 / population dynamics / deep sequencing / 接合移動 / 低コピー発現プラスミド / ケミカルジェノミクス

研究実績の概要

barcodeライブラリの完成、欠失を相補する接合可動型低コピー発現プラスミドライブラリーの構築、そして欠失株相補ライブラリーのリソース群の完成を目指した。その後構築したライブラリーによる高効率生理活性物質探索システムの構築を行うことを目的とした開発を目指した。barcodeによる混合培養液を用いて、長期定常期での各欠失株のpopulation変動を定量的にモニターすることが可能かどうかの評価を行った結果、少なくともbarcodeの量的変動をdeep sequencingで定量的に解析可能であることを確認することができた。その原理を用いて、化学物質の細胞内相互作用分子探索、作用機序解明を目的に、multi well プレートでの欠失株混合培養による競合培養とでdeep sequencingを用いた相互作用解析法の構築を行った。パイロットテストとして、細胞に対して毒性を示す溶媒など24種類の化合物を含む培地で欠失株混合液を生育させ、一定時間培養後に各wellの培養液より染色体DNAを抽出し、barcode領域をPCR増幅後、deep seqeuncingにより各欠失株のpopulation 変動を解析した。頻度解析を行い、その結果をクラスター解析を行うことで、化合物と各遺伝子との相互作用解析を行った。さらに新たな接合可動型プラスミドクローン発現ライブラリーとbarcode 欠失株を組合せ、発現誘導剤添加によるターゲット遺伝子の発現誘導増産による相互作用解析法の確立も進めた。薬剤による増産によるpopulation変動への影響は次年度に持ち越したが、ライブラリー構築は完成した。

現在までの達成度 (段落)

26年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

26年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] GenoBase: comprehensive resource database of Escherichia coli K-12 (2015)
  • 著者名/発表者名: Otsuka, Y., Muto, A., Takeuchi, R., Okada, C., Ishikawa, M., Nakamura, K., Yamamoto, N., Dose, H., Nakahigashi, K., Tanishima, S., Suharnan, S., Nomura, W., Nakayashiki, T., Aref, W. G., Bochner, B. R., Conway, T., Gribskov, M., Kihara, D., Rudd, K. E., Tohsato, Y., Wanner, B. L., Mori, H.
  • 雑誌名: Nucleic Acids Res 巻: 43 ページ: 606-617
  • DOI: 10.1093/nar/gku1164
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Colony-live -a high-throughput method for measuring microbial colony growth kinetics- reveals diverse growth effects of gene knockouts in Escherichia coli (2014)
  • 著者名/発表者名: Takeuchi, R. Tamura, T. Nakayashiki, T. Tanaka, Y. Muto, A. Wanner, B. L. Mori, H.
  • 雑誌名: BMC Microbiol 巻: 14 ページ: 171-182
  • DOI: 10.1186/1471-2180-14-171
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [図書] Identification of Essential Genes and Synthetic Lethal Gene Combinations in Escherichia coli K-12 (2014)
  • 著者名/発表者名: Hirotada Mori Katsushi Yokoyama Rikiya Takeuchi Kazuichi Makishi Wataru Nomura Yuta Otsuka Hitomi Dose Barry L. Wanner
  • 総ページ数: 21
  • 出版者: Springer
• [備考] GenoBase
  • URL: http://ecoli.naist.jp/GB