公募研究
新学術領域研究(研究領域提案型)
1. tropane alkaloidの生合成の解明に向けてベラドンナAtropa belladonna、コダチチョウセンアサガオDatura arborea、ヒヨスHyoscyamus niger、ハシリドコロ Scopolia japonicaのcDNAライブラリーの作製に取り組んだ。その結果、ベラドンナおよびヒヨスのcDNAライブラリーの作製に成功した。2. N-methyl-Δ1-pyrroliniumの微生物生産putrescineを出発物質とし、N-methyl-Δ1-pyrroliniumを生体内で生産する組換え大腸菌の作製を行った。Nicotiana tabacumのPutrescine N-methyltransferase（PMT）とN-methylputrescine oxidase（MPO）のcDNAをDUET vectorを用いて大腸菌で発現した。PMTを発現した大腸菌の培養液をダンシル化しHPLCで分析した結果、ダンシル化Putrescineとダンシル化Methylputrescineが確認された。また、PMTとMPOを共発現させた大腸菌の培養液をダンシル化しHPLCで分析した結果、ダンシル化Methylputrescineの生産量がPMTのみを発現させた場合と比較して減少していた。以上より、PMT、MPO共発現株ではN-methyl-Δ1-pyrroliniumが生産されていると考えられる。3. III型ポリケタイド合成酵素OKSと共に機能する新規サイクラーゼの探索西洋オトギリソウのデーターベースから環化酵素の候補を抽出し、それらの組換え蛋白質を大腸菌より調整した。候補蛋白質をOKSとin vitroで反応させたが、現在のところ、10以上の候補のうちエモジンアンスロンを合成する酵素は得られていない。
2: おおむね順調に進展している
1. tropane alkaloidの生合成の解明cDNAライブラリーの構築に成功し、発現ライブラリーを構築できた。当初の予定通りの進行度である。2. N-methyl-Δ1-pyrroliniumの微生物生産1.のライブライリーを用いたスクリーニングを行うため、前倒しで研究を開始し、N-methyl-Δ1-pyrroliniumの生産に成功した。3. III型ポリケタイド合成酵素OKSと共に機能する新規サイクラーゼの探索データベースからのスクリーニングには成功しなかったが、その場合はcDNAライブラリーからの探索を行う予定であり、既に植物体からのmRNAの抽出に取り組んでいる。
1. tropane alkaloidの生合成の解明ベラドンナおよびヒヨスのcDNAライブラリーの作製に成功しており、今後、type III polyketide synthaseをスクリーニングする。berberine bridge enzyme family (BBL)はReticulineを酸化し、Berberine骨格を形成する酵素である。また、Mannich反応を触媒する生合成酵素の報告例はないが、プロリンやリパーゼが不斉Mannich反応を触媒する報告例がある。今後、BBL酵素およびMannich反応を触媒する酵素をcDNAライブラリーからスクリーニングする。2. N-methyl-Δ1-pyrroliniumの微生物生産今後、標品N-methyl-Δ1-pyrroliniumを合成し、N-methyl-Δ1-pyrroliniumの直接的な分析系を構築する。3. III型ポリケタイド合成酵素OKSと共に機能する新規サイクラーゼの探索西洋オトギリソウからmRNAを調製し、cDNAの発現ライブラリーを構築する。また、III型ポリケタイド合成酵素OKSの微生物発現系を作製する。その際、acetyl-CoA carboxylaseを発現させるなど、基質の供給系も強化し、OKSによるオクタケタイド鎖の生産系を作る。この系に対し、西洋オトギリソウのcDNAの発現ライブラリーを発現し、新規サイクラーゼを探索する。
すべて 2014 2013
すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件) 学会発表 (5件)
Journal of Biological Chemistry
巻: 288 ページ: 34146-34157
