公募研究
新学術領域研究(研究領域提案型)
１）傷害脳を移動する新生ニューロンと活性化アストロサイトの相互作用の解析傷害脳を移動する新生ニューロンと活性化アストロサイトの動的な相互作用を理解するため、新生ニューロン・アストロサイトがそれぞれ異なる蛍光タンパク質によって標識される遺伝子改変マウスを用いて、脳梗塞後の脳スライスのタイムラプス撮影を行った。新生ニューロンは傷害部へ向けて活発に移動するが、活性化アストロサイトに接すると、移動速度の低下や移動方向の変化が見られた。Slit1ノックアウトマウスにおいては、活性化アストロサイトが存在する領域における新生ニューロンの移動速度が著しく低下し、移動を停止する細胞も多く見られた。２）移動する新生ニューロンとの接触による活性化アストロサイトのアクチン骨格制御重合アクチンを可視化するプローブを導入し、低酸素刺激により活性化・Robo受容体の発現を誘導したアストロサイトと脳室下帯由来の新生ニューロンを共培養し、新生ニューロンの接触によるアストロサイトのアクチン骨格の変化を解析した。タイムラプス撮影により、新生ニューロンが接触した部分で一過性にアストロサイトのアクチン重合度が低下することが示唆された。この反応は、Slit1を欠損する新生ニューロンとの共培養、活性化を誘導していないアストロサイトでは見られなかった。Roboシグナルの下流でアクチン骨格を制御する分子として知られているRhoA, Rac1, Cdc42のアストロサイトにおける活性のダイナミクスを、FRETプローブを用いて可視化し、新生ニューロンとの共培養系で解析した。新生ニューロンの接触により、アストロサイト内のCdc42活性が局所的・一過性に低下した。以上より、新生ニューロンがSlit-Roboシグナルを介するCdc42不活性化により、活性化アストロサイトの細胞骨格を制御していることが示唆された。
1: 当初の計画以上に進展している
脳梗塞モデルマウスを用いた予備的実験から、１）傷害によって活性化したアストロサイトがRobo受容体を発現すること、２）活性化アストロサイトにおけるRobo発現を抑制すると、新生ニューロンの移動が抑制されること、３）Slit1を欠損した新生ニューロンでは傷害部への移動が抑制されること、４）新生ニューロンと接した活性化アストロサイトが活発に形態を変化させること、が示唆されていた。これらのデータについては、平成２５年度中に個体数の追加を行い、統計学的に有意な差が見られることを確認した。更に本年、遺伝子改変マウスを用いた傷害脳のイメージング実験によって、傷害脳を移動する新生ニューロンと周囲の活性化アストロサイトのダイナミックな相互作用を観察することに成功した。この方法は、動的な細胞間の相互作用の解析を課題とする本研究において非常に有用であり、研究の発展に大きく寄与することが期待される。分子メカニズムの解析については、申請者独自の新生ニューロン－アストロサイト共培養システムを用いて、新生ニューロンの接触によるアクチン骨格制御という非常に興味深い知見を得ることができた。このアクチン骨格の変化は、Slit-RoboシグナルによるCdc42活性抑制を介する可能性が示唆されている。これまで、活性化アストロサイトの役割として、傷害後の急性期における炎症の鎮静化や、再生過程への関与が報告されている。しかし本研究では、新生ニューロンの移動における活性化アストロサイトの役割の解析のみに留まらず、新生ニューロンからのシグナルによる活性化アストロサイトの制御という、新しいメカニズムの存在を示唆するデータが蓄積されてきており、計画以上に進展していると判断した。
１）Slitシグナル増強による活性化アストロサイトとの相互作用の変化の解析：これまでの解析から、新生ニューロンにおけるSlit1の発現は、脳室下帯を離れて傷害部に向けて移動を開始すると低下していくことが分かった。また、脳梗塞モデル脳の長時間タイムラプス撮影により、Slit1欠損マウス脳では、活性化アストロサイトの分布領域において、新生ニューロンの移動速度が著しく低下することが分かった。そこで、Slit1遺伝子をコードするレンチウィルスを作製し、新生ニューロンにおいてSlit1の持続発現を誘導したときの、活性化アストロサイトとの相互作用や傷害部への移動形態を、タイムラプス撮影により記録し解析する。２）電子顕微鏡解析の導入：これまでに行った新生ニューロン-活性化アストロサイトの共培養実験から、新生ニューロンの接触により、アストロサイトのアクチン細胞骨格に変化が生じることが示唆された。そこで、新生ニューロンと活性化アストロサイトの接触によって生じる構造変化を明らかにするため、電子顕微鏡を用いて接触部の超微細構造を解析する。また、Slit1欠損新生ニューロンやSlit1持続発現ベクターを用いて、接触部のアストロサイトの微細構造の変化における新生ニューロンのSlitの役割を明らかにする。３）新生ニューロンによるアストロサイト細胞骨格制御メカニズムの解析昨年度の解析により、新生ニューロンがSlitを介して活性化アストロサイトのアクチン重合・Cdc42活性を局所的・一時的に負に制御することが分かった。この両者の関係を明らかにするため、恒常活性型または野生型のCdc42を導入したアストロサイトにおいて、新生ニューロンの接触によりアクチン重合の抑制が生じるかを解析する。
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すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 1件) 学会発表 (6件) (うち招待講演 1件) 図書 (4件)
Frontiers in Cellular Neuroscience
巻: 7 ページ: 235-235
10.3389/fncel.2013.00235
Clinical Neuroscience
巻: 31 ページ: 1446-1448
