時計タンパク質CRYの安定化と分解という拮抗作用を導く2種類のE3リガーゼ

2013 年度 実績報告書

• 研究領域: ユビキチンネオバイオロジー：拡大するタンパク質制御システム
• 研究課題/領域番号: 25112504
• 研究種目: 新学術領域研究(研究領域提案型)
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 深田 吉孝 東京大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (80165258)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: サーカディアンリズム / 生物時計 / CRY / タンパク質分解 / ユビキチン

研究概要

F-box型E3リガーゼFBXL21は時計タンパク質CRYをポリユビキチン化して安定化する。本年度は、FBXL21によるユビキチン化のユニークな分子特性を理解するための第一歩として、in vitroユビキチン化反応の構築を目指した。SCF複合体の構成因子であるSKP1・CUL1・RBX１に加えてFBXL3あるいはFBXL21とCRY1やCRY2を昆虫細胞発現系を用いて合成し精製した。現状ではSCF複合体の可溶化効率が低く、引き続き条件検討が必要であるが、FBXL3やFBXL21と共に働くE2酵素の同定を目指すと共に、ユビキチン化反応条件を探っている。
一方、CRY1およびCRY2の網羅的相互作用解析によって同定された脱ユビキチン化酵素USP7を遺伝子クローニングし、CRY2と共発現させた細胞内においてCRY2とUSP7が結合していることを確認した。さらにin vitroユビキチン化したCRY2をUSP7が脱ユビキチン化することを示した。また、分解アッセイにおいてUSP7の共発現によりCRY1やCRY2の発現量が増え、CRYタンパク質が安定化されることを見出した。USP7の生理的役割を探るため、培養条件下での細胞リズムに対するUSP7の効果を解析した。Bmal1-lucで細胞リズムを可視化する系を用いて、USPの過剰発現が細胞リズムの概日周期を増大し、Usp7のノックダウンにより細胞時計の周期が短縮することを明らかにした。USP7はFBXL3によるCRYの分解と拮抗して安定化すると結論した。一方、CRY1およびCRY2の相互作用分子として同定したFBXO30についても解析を進めたが、FBXO30はCRY1やCRY２の安定性の制御には寄与していないと結論した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究プロジェクトは、F-box型E3リガーゼFBXL21が時計タンパク質CRYを安定化するという予想外の現象に対して、その分子的なメカニズムの解明を目的としてスタートした。本年度にはまず、CRYのin vitroユビキチン化反応系の構築に向けてその準備が整った。また、CRYタンパク質とのインタラクトーム解析により脱ユビキチン化酵素USP7を同定し、CRYのユビキチン化様式の相互転換スイッチとしてUSP7が機能する可能性を示した。このように当初の計画の通りおおむね順調に進展している。

今後の研究の推進方策

FBXL21がCRYを安定化するメカニズムの解明を目指して研究を展開する。FBXL21によるCRYユビキチン化の結合様式を決定するとともに、USP7を切り口にCRY安定性の制御機構を解き明かす。さらにこれと並行して、BMAL1やDBPなどの時計タンパク質の安定性制御メカニズムにも分子レベルで切り込みたい。

研究成果

• [雑誌論文] The circadian clock regulates the NRF2/ARE-mediated antioxidant defence pathway in the mouse lung. (2014)
  • 著者名/発表者名: Vanja Pekovic-Vaughan, Julie Gibbs, Hikari Yoshitane, Nan Yang, Dharshika Pathiranage, Baoqiang Guo, Aya Sagami, Keiko Taguchi, David Bechtold, Andrew Loudon, Masayuki Yamamoto, Jefferson Chan, Gijsbertus T.J. van der Horst, Yoshitaka Fukada and Qing-Jun Meng
  • 雑誌名: Genes Dev. 巻: 28 ページ: 548-560
  • DOI: 10.1101/gad.237081.113
  • 査読あり
• [雑誌論文] F-boxタンパク質による時計タンパク質の安定性制御と行動リズムの制御 (2013)
  • 著者名/発表者名: 平野有沙、深田吉孝
  • 雑誌名: 実験医学 巻: 31 ページ: 2140-2143
• [雑誌論文] FBXL21は時計タンパク質CRYをユビキチン化修飾して安定化することにより概日リズムを制御する (2013)
  • 著者名/発表者名: 平野有沙、深田吉孝
  • 雑誌名: 細胞工学 巻: 32 ページ: 796-798
• [学会発表] Ubiquitination-mediated regulation of CRY proteins stability is important for mammalian circadian clock. (2013)
  • 著者名/発表者名: Yoshitaka Fukada
  • 学会等名: Gordon Research Conferences:Chronobiology
  • 発表場所: サルブ レジーナ大学（ロードアイランド衆 米国）
  • 年月日: 20130714-20130715
• [学会発表] Stabilization of mouse CRY proteins by FBXL21 is critical for circadian oscillation of the biological clock.～in vivo analysis of Fbxl21 in mice～
  • 著者名/発表者名: 深田吉孝、平野 有沙、弓本 佳苗、恒松 良佑、松本 雅記、尾山 大明、秦 裕子、中川 智貴、ランジャコーンシリパン ダーリン、中山 敬一
  • 学会等名: 第35回内藤記念コンファランス
  • 発表場所: シャトレーゼ ガトーキングダム(札幌市 北海道)
• [学会発表] Stabilization of mouse CRY proteins by FBXL21 is critical for circadian oscillation of the biological clock.～Molecular characterization of FBXL21 in circadian clockwork～
  • 著者名/発表者名: Arisa Hirano, Kanae Yumimoto, Ryosuke Tsunematsu, Masaki Matsumoto, Masaaki Oyama, Hiroko Kozuka-Hata, Tomoki Nakagawa, Darin Lanjakornsiripan, Keiichi I. Nakayama and Yoshitaka Fukada.
  • 学会等名: 第35回内藤記念コンファランス
  • 発表場所: シャトレーゼ ガトーキングダム(札幌市 北海道)
• [学会発表] FBXL21-mediated ubiquitination and stabilization of CRY1 and CRY2 are essential for mouse behavioral rhythm.
  • 著者名/発表者名: Arisa Hirano, Kanae Yumimoto, Ryosuke Tsunematsu, Masaki Matsumoto, Masaaki Oyama, Hiroko Kozuka-Hata, Tomoki Nakagawa, Darin Lanjakornsiripan, Keiichi I. Nakayama and Yoshitaka Fukada.
  • 学会等名: XIII congress of the EBRS
  • 発表場所: Medical School of the Ludwig-Maximilians-University（ミュンヘン市 独国）
• [学会発表] 時計タンパク質CRYの脱ユビキチン化を担う酵素.
  • 著者名/発表者名: 中川 智貴、平野 有沙、深田 吉孝
  • 学会等名: 第86回日本生化学会大会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県）
• [学会発表] F-box型E3リガーゼFBXL21によるCRYタンパク質の安定化と概日時計の発振制御.
  • 著者名/発表者名: 平野 有沙、弓本 佳苗、恒松 良佑、松本 雅記、尾山 大明、秦 裕子、中川 智貴, ランジャコーンシリパン ダーリン、中山 敬一、深田 吉孝
  • 学会等名: 第86回日本生化学会大会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県）
  • 招待講演
• [学会発表] CRYタンパク質のマルチユビキチン化修飾によるマウス行動リズムの制御.
  • 著者名/発表者名: 深田 吉孝
  • 学会等名: 日本動物学会第84回岡山大会
  • 発表場所: 岡山大学津山キャンパス（岡山県）
  • 招待講演
• [学会発表] CRYタンパク質の安定性を制御する複雑なユビキチン化ネットワーク.
  • 著者名/発表者名: 平野 有沙、中川 智貴、弓本 佳苗、恒松 良佑、松本 雅記、尾山 大明、秦 裕子、, ランジャコーンシリパン ダーリン、中山 敬一、深田 吉孝
  • 学会等名: 第20回日本時間生物学術大会
  • 発表場所: 近畿大学東大阪キャンパス（大阪府）
  • 招待講演
• [学会発表] 時計タンパク質 CRY の安定化を担う脱ユビキチン化酵素.
  • 著者名/発表者名: 中川 智貴、平野 有沙、深田 吉孝
  • 学会等名: 第20回日本時間生物学術大会
  • 発表場所: 近畿大学東大阪キャンパス（大阪府）
• [学会発表] FBXL21とFBXL3による時計タンパク質CRYのユビキチン化を介した体内時計への拮抗作用.
  • 著者名/発表者名: 深田 吉孝
  • 学会等名: 第36回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド（兵庫県）
  • 招待講演
• [学会発表] 時計細胞におけるCRYタンパク質の量的制御の仕組み.
  • 著者名/発表者名: 深田 吉孝
  • 学会等名: 第2回視交叉上核アリーナ
  • 発表場所: 北海道大学（札幌市 北海道）
  • 招待講演
• [備考] 深田研究室
  • URL: http://www.biochem.s.u-tokyo.ac.jp/fukada-lab/index-j.html