E3ユビキチンリガーゼの機能ドメイン形成によるT細胞活性化制御機構の解明

2013 年度 実績報告書

• 研究領域: 細胞機能と分子活性の多次元蛍光生体イメージング
• 研究課題/領域番号: 25113725
• 研究種目: 新学術領域研究(研究領域提案型)
• 研究機関: 独立行政法人理化学研究所
• 研究代表者: 横須賀 忠 独立行政法人理化学研究所, 統合生命医科学研究センター, 上級研究員 (10359599)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: 免疫学 / シグナル伝達

研究概要

T細胞が抗原提示細胞から情報を受け取る際、T細胞受容体(TCR)とその下流のシグナル伝達分子から成る凝集塊「TCRマイクロクラスター」が形成され、T細胞の活性化を誘導する。アレルギーや自己免疫疾患で起こっているT細胞の過度な活性化を制御する目的で、TCRマイクロクラスターの視点からそれを抑制する制御分子を研究してきた。本課題研究では、E3ユビキチンリガーゼc-ClbおよびCbl-bが構成する新規クラスターを可視化し、TCRの取り込み・分解とT細胞活性の抑制メカニズムを明らかにすることを目的とする。
1　ユビキチンのイメージング解析：c-CblおよびCbl-bのエフェクター分子ユビキチンを可視化するため、ユビキチンと蛍光タンパクのキメラ分子、および、リジン残基K48およびK63のユビキチン結合を特異的に認識するプローブを新規作成した。TCRマイクロクラスターに集まってくるユビキチンはシグナル伝達分子の活性化やインターナリゼーションを示すK63結合が多く、タンパク分解を示すK48結合は少なかった。これは、リジン残基の結合に得意的なモノクローナル抗体を用いた実験でも示された。
2　直鎖型ユビキチンのイメージング解析：NF-κB経路の活性化に重要と考えられているファーストメチオニン残基(M1)を、M1特異的に認識するプローブを用いてT細胞活性化におけるM1結合ユビキチンの局在を探索したが、M1結合を示すユビキチンはTCRマイクロクラスターに優位に存在しなかった。
3　遺伝子欠損マウスを用いたイメージング解析：c-CblおよびCbl-b遺伝子欠損マウス由来末梢T細胞を用いTCRマイクロクラスターの挙動を可視化したところ、Cbl-b遺伝子欠損細胞にて激しくTCRの取り込みが低下していること、代わりにTCR下流のシグナル伝達分子が停滞することが分かった。また、Cbl-b遺伝子欠損によるK63ユビキチンのTCRマイクロクラスターへの凝集の低下も明らかであった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

リジン残基K48のユビキチン結合を特異的に認識するプローブを新規作成できたことは、ユビキチン研究において非常に優位な成果である。また、これらのプローブを用い、TCRマイクロクラスターとE3ユビキチンリガーゼおよびユビキチンとの可視化に成功し、本年度の研究実施計画を沿った実験が行うことが出来ている。

今後の研究の推進方策

イメージングで得られた結果と疾患との関連性を示すため、変異型Cblを責任分子とする骨髄異形成症候群をモデル化し、過度に活性化したCblと疾患発症の原因探索、さらにはアレルギー発症のモデル化を行う。また、これまでの末梢T細胞を用いた実験を、胸腺T細胞にも拡大し、c-CblおよびCbl-bアイソフォームによる機能の違い、胸腺T細胞と末梢T細胞との相違点、自己免疫疾患発症に寄与する胸腺内T細胞シグナルの破綻、などを解明する。

研究成果

• [雑誌論文] The lymphoid lineage-specific actin-uncapping protein Rltpr is essential for costimulation via CD28 and the development of regulatory T cells (2013)
  • 著者名/発表者名: *Yinming Liangv, *Margot Cucchetti, *Romain Roncagalli, *Tadashi Yokosuka, Aurelie Malzac, Elodie Bertosio, Jean Imbert, Isaac J Nijman, Miloslav Suchanek, Takashi Saito, Christoph Wulfing, Bernard Malissen, Marie Malissen (*equally contributed)
  • 雑誌名: Nature Immunology 巻: 14 ページ: 858-866
  • DOI: 10.1038/ni.2634
  • 査読あり
• [雑誌論文] リンパ球に特異的なアクチン脱キャッピングタンパク質RltprはCD28を介するT細胞の活性化と制御性T細胞の分化に必須である (2013)
  • 著者名/発表者名: 横須賀忠、斉藤隆、Bernard Malissen
  • 雑誌名: ライフサイエンス新着論文レビュー 巻: - ページ: -
• [学会発表] Distinct signalosome formation by two Ras-GEFs to activate the Ras-MAPK pathway in T cell signaling (2013)
  • 著者名/発表者名: Tadashi Yokosuka, Akiko Hashimoto-Tane, Takashi Saito
  • 学会等名: 第42回日本免疫学会総会学術集会
  • 発表場所: 幕張メッセ（千葉）
  • 年月日: 20131211-20131213
• [学会発表] Arp2/3 complex-mediated actin-nucleation supports T cell receptor microcluster (2013)
  • 著者名/発表者名: kiko Hashimoto-Tane, Tadashi Yokosuka, Takashi Saito
  • 学会等名: 第42回日本免疫学会総会学術集会
  • 発表場所: 幕張メッセ（千葉）
  • 年月日: 20131211-20131213
• [学会発表] Basilic, a lymphoid-specific protein essential for CD28 costimulation and regulatory T cell development (2013)
  • 著者名/発表者名: Marie Malissen, Yinming Liangv, Margot Cucchetti, Romain Roncagalli, Tadashi Yokosuka, Takashi Saito, Christoph Wulfing, Bernard Malissen
  • 学会等名: International Congress of Immunology 2013
  • 発表場所: Italia Milano
  • 年月日: 20130822-20130827