リン酸化制御因子による細胞壁構築ダイナミクスの解明

2013 年度 実績報告書

• 研究領域: 植物細胞壁の情報処理システム
• 研究課題/領域番号: 25114514
• 研究種目: 新学術領域研究(研究領域提案型)
• 研究機関: 東京理科大学
• 研究代表者: 松永 幸大 東京理科大学, 理工学部, 准教授 (40323448)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: 細胞分裂 / キナーゼ / 細胞壁 / 植物

研究概要

植物AURは、紡錘体や細胞板に局在するα型と動原体に局在するβ型に分けることができる。α型のシロイヌナズナAURであるAtAUR1/2が細胞質分裂に関与することから、細胞質分裂の最終過程である細胞壁構築を植物のα型AURが制御する可能性が高い。そこで本研究課題は、細胞壁構築におけるAURによるリン酸化情報処理システムを明らかにすることを目的とした。
1. AUR自己リン酸化モノクローナル抗体の作成
構造予測とAURのキナーゼアッセイの結果からα型AURの自己リン酸化部位はAtAUR1：T185、 AtAUR2:T173と予想された。そこでリン酸化修飾ペプチドを中央にして周囲5アミノ酸からなる11残基のペプチドを合成した。抗体の特異性評価のために、リン酸化ペプチドと非リン酸化ペプチドの二つを作製した。HPLC精製後、マウスに免疫しハイブリドーマを得た。ハイブリドーマ上清から、分子間相互作用検出装置Biacoreにより計測したKd値を基に、非リン酸化ペプチドには結合せず、リン酸化ペプチドに結合するもっとも特異性の高い抗体を選抜した。リガンドチオールカップリングでセンサーチップにペプチドを固定し、ハイブリドーマ上清を流路に流し、結合と解離をBiacore解析した。
2. AURのリン酸化プロテオーム解析とキナーゼアッセイ
AUR変異体の細胞抽出液を用いて、フーリエ変換リニアイオントラップによるハイブリッド質量分析計LTQ Orbitrap XLで分析しリン酸化ペプチドを同定した。放射性同位元素32Pを使用せず、ATPγSにより形成されるチオリン酸エステルを抗体で検出するNon-RIキナーゼアッセイにより、リン酸化修飾されるセリン/スレオニン残基を特定した。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

AURのリン酸化プロテオーム解析とキナーゼアッセイ解析により多数の基質が同定された上に、転写因子のアルファスクリーニング解析によっても多数の基質が同定された。その中の因子はリン酸化アッセイにより実際に基質となっていることを確認した上に、具体的にリン酸化されるアミノ酸部位まで同定できた。これは細胞壁構築メカニズムを知る上で、当初の計画以上に進展している研究成果と言える。

今後の研究の推進方策

前年度、同定した基質と相互作用因子を蛍光タンパク質に連結してイメージングラインを作製する。このラインをライブイメージングで解析すると共に、タンパク質動態をFRAP解析する。FRAP解析にはAURリン酸化部位をアラニンに置換した非リン酸化変異体や、アスパラギン酸に置換したリン酸化ミミック変異体も作成し解析する。さらに、新学術領域の計画班と連携を続け、細胞壁構築におけるオーロラキナーゼのリン酸化ネットワークの解明を目指す。

研究成果

• [雑誌論文] Chromophore-assisted laser inactivation towards a spatiotemporal-functional analysis of proteins, and the ablation of chromatin, organelle and cell function. (2014)
  • 著者名/発表者名: Sano, Y., Watanabe, W. and Matsunaga, S.
  • 雑誌名: JOURNAL OF CELL SCIENCE 巻: 127 ページ: 1621-1629
  • DOI: 10.1242/jcs.144527
  • 査読あり
• [雑誌論文] The boundary of the meristematic and elongation zones in roots: endoreduplication precedes rapid cell expansion (2013)
  • 著者名/発表者名: Kohma Hayashi, Junko Hasegawa, Sachihiro Matsunaga
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 3 ページ: 2723
  • DOI: 10.1038/srep02723
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cytokinins control endocycle onset by promoting the expression of an APC/C activator in Arabidopsis roots. (2013)
  • 著者名/発表者名: Takahashi, N., Kajihara, T., Okamura, C., Kim, Y., Katagiri, Y., Okushima, Y., Matsunaga, S., Hwang, I., and Umeda, M.
  • 雑誌名: CURRENT BIOLOGY 巻: 23 ページ: 1812-1817
  • DOI: 10.1016/j.cub.2013.07.051
  • 査読あり
• [雑誌論文] New insights into the dynamics of plant cell nuclei and chromosomes. (2013)
  • 著者名/発表者名: Matsunaga, S., Katagiri, Y., Nagashima, Y., Sugiyama, T., Hasegawa, J., Hayashi, K. and Sakamoto, T.
  • 雑誌名: INTERNATIONAL REVIEW OF CELL AND MOLECULAR BIOLOGY 巻: 305 ページ: 253 - 301
  • DOI: 10.1016/B978-0-12-407695-2.00006-8.
  • 査読あり
• [雑誌論文] The kinesin-like protein TOP promotes Aurora localisation and induces mitochondrial, chloroplast and nuclear division. (2013)
  • 著者名/発表者名: Yoshida, Y., Fujiwara, T., Imoto, Y., Yoshida, M., Ohnuma, M., Hirooka, S., Misumi, O., Kuroiwa, H. Kato, S., Matsunaga, S. and Kuroiwa, T.
  • 雑誌名: JOURNAL OF CELL SCIENCE 巻: 126 ページ: 2392-2400
  • DOI: 10.1242/jcs.116798.
  • 査読あり
• [学会発表] 植物の動原体局在型オーロラキナーゼは微小管プラス末端制御タンパク質EB1をリン酸化する (2013)
  • 著者名/発表者名: 松永幸大、北原英里奈、栗原大輔、小牧伸一郎、高木麻衣、佐野行己、長島慶宜、中神弘史、伊藤正樹、杉本慶子、橋本隆、松永朋子、坂本卓也
  • 学会等名: 第36回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド
  • 年月日: 20131203-20131206
• [学会発表] Imaging analyses of DNA replication and cell division in root development
  • 著者名/発表者名: Sachihiro Matsunaga
  • 学会等名: 第55回日本植物生理学会年会
  • 発表場所: 富山大学 五福キャンパス
• [学会発表] Subnuclear dynamics and cell dynamics in root morphogenesis.
  • 著者名/発表者名: Sachihiro Matsunaga
  • 学会等名: Workshop on Modeling Biomolecular Systems in Cellular Environment
  • 発表場所: 京都大学理学研究科セミナーハウス
  • 招待講演
• [図書] Atlas of Plant Cell Structure (2014)
  • 著者名/発表者名: Noguchi, T., Kawano, S., Sakai, A.. Hayashi, Y., Karahara, I., Matsunaga, S., Tsukaya, H.
  • 総ページ数: 未定
  • 出版者: Ｓｐｒｉｎｇｅｒ
• [備考] 研究者情報ベースRIDAI
  • URL: https://www.tus.ac.jp/fac_grad/p/achievement.php?64d9