運動マシナリーとしてのＡＡＡ型分子シャペロン

2013 年度 実績報告書

• 研究領域: 運動超分子マシナリーが織りなす調和と多様性
• 研究課題/領域番号: 25117517
• 研究種目: 新学術領域研究(研究領域提案型)
• 研究機関: 熊本大学
• 研究代表者: 小椋 光 熊本大学, 発生医学研究所, 教授 (00158825)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: AAA型分子シャペロン / 分子シャペロン / モーター / タンパク質 / ATPase

研究概要

AAA型分子シャペロンp97のATP依存的回転運動についての高速原子間力顕微鏡（AFM）解析の結果をまとめ、Structure誌に発表した。D2ドメインの構造変化を解明するため、N末端にHisタグをつけ、マイカ上に固定して観察できる系を構築し、現在解析を行っている。また、Gluスイッチやinterprotomer motion transmission機構の変異体を構築し、現在精製を行っている。26Sプロテアソームの高速AFM観察条件を検討し、クライオ電顕の解像度に迫るイメージを取得する観察条件を見出すことに成功している。現在の観察速度は1フレーム/秒である。さらに条件を検討すれば、さらに高速で高分解能の画像を得ることが可能であると考えられる。また、基質タンパク質の高速AFM観察もできている。こちらは、高速観察に成功しており、不安定なドメインがふらふら動く様子が観察できている。26Sプロテアソームに基質タンパク質が結合して、分解に至る一部始終を高速AFM画像として捉えることが目的なので、ATPγS存在下で、基質-26Sプロテアソーム複合体の観察に挑んでいるが、これまでのところ基質-26Sプロテアソーム複合体の形成頻度は低く、さらに条件を検討する必要がある。水溶液中では基質分解活性を認めているので、高速AFM観察の適切な条件を見つけることができると考える。FtsHの高速AFM観察についてはまだ十分に条件検討ができていない。また、ATP結合や加水分解の変異体の構築・精製を進めている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

26Sプロテアソームの観察条件が順調に適正化できていることから、全体的に順調に成果が上がっている。次年度は26Sプロテアソームの解析が進むことが期待できる。

今後の研究の推進方策

26Sプロテアソームの動態観察やp97変異体及び阻害剤を用いた解析等を中心に研究を推進し、課題の目的の達成を図る。

研究成果

• [雑誌論文] High-speed atomic force microscopic observation of ATP-dependent rotation of the AAA+ chaperone p97. (2013)
  • 著者名/発表者名: Noi, K., Yamamoto, D., Nishikori, S., Arita-Morioka, K., Kato, T., Ando, T., and Ogura, T.
  • 雑誌名: Structure 巻: 21 ページ: 1992-2002
  • DOI: 10.1016/j.str.2013.08.017. Epub 2013 Sep 19.
  • 査読あり
• [学会発表] Yeast Cdc48-20S proteasome complex in vitro and in vivo. (2014)
  • 著者名/発表者名: Esaki, M., Noi, K., and Ogura, T.
  • 学会等名: 231st IMEG seminars & Minisymposium
  • 発表場所: 熊本市 熊本大学発生医学研究所
  • 年月日: 20140221-20140222
• [学会発表] High-speed AFM imaging of the 26S proteasome dynamics. (2014)
  • 著者名/発表者名: Okuno, T., Noi, K., Okawa, A., Tsuchiya, H., Saeki, Y., Takahashi, K., Inobe, T., Yamanaka, K., and Ogura, T.
  • 学会等名: 231st IMEG seminars & Minisymposium
  • 発表場所: 熊本市 熊本大学発生医学研究所
  • 年月日: 20140221-20140222
• [学会発表] Observation of AAA chaperone p97 by high-speed AFM. (2014)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto, D., Noi, K., Arita-Morioka, K, Ando, T., and Ogura, T.
  • 学会等名: 231st IMEG seminars & Minisymposium
  • 発表場所: 熊本市 熊本大学発生医学研究所
  • 年月日: 20140221-20140222
• [学会発表] Biochemical properties of FtsH protease from plants. (2014)
  • 著者名/発表者名: Ueda, E., Noi, K., Arita-Morioka, K., Ogura, T., Sakamoto, W., Hisabori, T., and Amano, T.
  • 学会等名: 231st IMEG seminars & Minisymposium
  • 発表場所: 熊本市 熊本大学発生医学研究所
  • 年月日: 20140221-20140222
• [学会発表] High-speed AFM observation of ATP-dependent rotation of the AAA chaperone p97 and its interaction with TDP-43 amyloid fibrils. (2014)
  • 著者名/発表者名: Noi, K., Yamamoto, D., Arita-Morioka, K., Ando, T., and Ogura, T.
  • 学会等名: 231st IMEG seminars & Minisymposium
  • 発表場所: 熊本市 熊本大学発生医学研究所
  • 年月日: 20140221-20140222
• [学会発表] 植物由来FtsHプロテアーゼの分子機構. (2013)
  • 著者名/発表者名: 斉藤 勝広, 植田 依里, 柿本 衿菜, 鈴木 香於里, 原 怜, 久堀 徹, 加藤 裕介, 坂本 亘, 野井 健太郎, 有田 健一, 小椋 光, 天野 豊己
  • 学会等名: 日本生体エネルギー研究会第39回討論会
  • 発表場所: 静岡市, 静岡県コンベンションアーツセンター
  • 年月日: 20131218-20131220
• [学会発表] In vivo においてCdc48は20Sプロテアソーム複合体と相互作用する. (2013)
  • 著者名/発表者名: 江崎 雅俊, 野井 健太郎, 佐伯 泰, 小椋 光
  • 学会等名: 第36回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 神戸市、神戸国際展示場
  • 年月日: 20131203-20131206
• [学会発表] 高速AFMによる26Sプロテアソームのダイナミクス解析. (2013)
  • 著者名/発表者名: 奥野 貴士, 野井 健太郎, 大川 阿紀子, 土屋 光, 佐伯 泰, 高橋 一暢, 伊野部 智由, 山中 邦俊, 小椋 光
  • 学会等名: 第36回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 神戸市、神戸国際展示場
  • 年月日: 20131203-20131206
• [学会発表] Dynamics of p97 and the 26S proteasome in action revealed by high-speed atomic force microscopy. (2013)
  • 著者名/発表者名: Ogura, T., Noi, K., Okuno, T., Arita-Morioka, K., Yamamoto, D., Okawa, A., Tsuchiya, H., Saeki, Y., Ando, T., Esaki, M., and Yamanaka, K.
  • 学会等名: EMBO Workshop on AAA+ Proteins
  • 発表場所: Commundo Hotel, Neuss, Germany.
  • 年月日: 20130915-20130919
  • 招待講演
• [学会発表] Non-consevation of the aromatic residue in the D1 pore loop of yeast Cdc48 is essential for cell viability. (2013)
  • 著者名/発表者名: Esaki, M., and Ogura, T.
  • 学会等名: EMBO Workshop on AAA+ Proteins
  • 発表場所: Commundo Hotel, Neuss, Germany.
  • 年月日: 20130915-20130919
• [学会発表] Biochemical analysis of molecular mechanisms of the interaction between VCP/p97 and amyloid fibrils of TDP-43. (2013)
  • 著者名/発表者名: Noi, K., Arita-Morioka, K., Ogi, H., Hirao, M., and Ogura, T.
  • 学会等名: EMBO Workshop on AAA+ Proteins
  • 発表場所: Commundo Hotel, Neuss, Germany.
  • 年月日: 20130915-20130919
• [学会発表] 分子シャペロンVCP/p97とTDP-43アミロイド線維の相互作用の分子機構の解析. (2013)
  • 著者名/発表者名: 野井 健太郎, 有田ー森岡 健一, 小椋 光
  • 学会等名: 第13回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: 鳥取市、とりぎん文化会館
  • 年月日: 20130612-20130614
• [学会発表] AAA chaperones, focusing on the molecular mecanism of p97. (2013)
  • 著者名/発表者名: Ogura, T., Noi, K., Arita-Morioka, K., Yamamoto, D., Ando, T., Nishikori, S., Esaki, M., and Yamanaka, K.
  • 学会等名: EMBO Conference
  • 発表場所: Santa Margherita de Pula, Italy.
  • 年月日: 20130517-20130522
  • 招待講演
• [図書] Subcell. Biochem. (2013)
  • 著者名/発表者名: Okuno, T., and Ogura, T.
  • 総ページ数: 17
  • 出版者: Springer
• [備考] 熊本大学発生医学研究所分子細胞制御分野のホームページ
  • URL: http://mukb.medic.kumamoto-u.ac.jp/fukusei/index.html
• [備考] 熊本大学発生医学研究所分子細胞制御分野 AAAホームページ
  • URL: http://mukb.medic.kumamoto-u.ac.jp/AAA/aaainfo.html
• [備考] 熊本大学発生医学研究所のホームページ
  • URL: http://www.imeg.kumamoto-u.ac.jp/index.html