無細胞蛋白質アレイによるポリユビキチン鎖依存シグナル伝達経路の網羅的同定と解析

2013 年度 実績報告書

• 研究領域: 翻訳後修飾によるシグナル伝達制御の分子基盤と疾患発症におけるその破綻
• 研究課題/領域番号: 25117719
• 研究種目: 新学術領域研究(研究領域提案型)
• 研究機関: 愛媛大学
• 研究代表者: 澤崎 達也 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 教授 (50314969)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: ユビキチン / 無脂肪タンパク質合成 / ポリユビキチン鎖 / プロテインアレイ / コムギ胚芽 / シグナル伝達

研究概要

I．種々のポリユビキチン鎖への相互作用検出技術の確立
予備実験的には成功していたポリユビキチン鎖に結合するタンパク質を高感度に検出できる技術の最適化を行った。その結合検出方法には、アルファスクリーン法を利用した。その原理は、384穴プレート中で、Flagタグでラベルされたユビキチン鎖（モノUb、ダイUb-Ub、テトラUb-Ub-Ubのいずれか）とビオチン化プロテインアレイタンパク質を反応させて、その後ドナービーズとアクセプタービーズを加えて反応させる。もし、ポリユビキチン鎖との相互作用反応が起これば、抗Flag抗体を介して双方のビーズが近接する。このような状態でドナービーズを励起すると、このエネルギーが近接したアクセプタービーズと反応し蛍光を発する。しかし、相互作用が起こらなければ、双方のビーズが近接できず、蛍光を発することができない。本手法を用いて、既知に報告されているA20タンパク質のZF7ドメインと直鎖状型ポリユビキチン鎖との結合を検出することができた。この事は、高感度にポリユビキチン鎖への相互作用反応が検出できる技術が確立できたことを意味する。
II．アルファスクリーン法によるK63および直鎖状ポリユビキチン鎖と相互作用するシグナル伝達関連蛋白質の同定
我々の研究室で進めきた手法を用いて、Ｎ末端にビオチン化した各種組換えプロテインアレイを構築することができた。最終的には、約400種のプロテインキナーゼ、250種のE3リガーゼおよび50種類の相互作用タンパク質からなるプロテインアレイを作成することに成功した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

計画どおりに、ポリユビキチン鎖と結合するタンパク質のハイスループットな検出技術の確立、およびプロテインアレイの構築に成功しているため。

今後の研究の推進方策

本技術を用いて、ポリユビキチン鎖に結合するタンパク質の網羅的な解析を行う。

研究成果

• [雑誌論文] Myosin phosphatase is inactivated by caspase-3 cleavage and phosphorylation of myosin phosphatase targeting subunit 1 during apoptosis. (2013)
  • 著者名/発表者名: Iwasaki T, Katayama T, Kohama K, Endo Y, Sawasaki T.
  • 雑誌名: Mol Biol Cell 巻: 24 ページ: 748-756
  • DOI: 10.1091/mbc.E11-08-0740
  • 査読あり
• [雑誌論文] Anti-interleukin-5 and multiple autoantibodies are associated with human atherosclerotic diseases and serum interleukin-5 levels. (2013)
  • 著者名/発表者名: Ishigami T, Abe K, Aoki I, Minegishi S, Ryo A, Matsunaga S, Matsuoka K, Takeda H, Sawasaki T, Umemura S, Endo Y.
  • 雑誌名: FASEB J. 巻: 27 ページ: 3437-3445
  • DOI: 10.1096/fj.12-222653
  • 査読あり
• [雑誌論文] Nek5, a novel substrate for caspase-3, promotes skeletal muscle differentiation by up-regulating caspase activity. (2013)
  • 著者名/発表者名: Shimizu K, Sawasaki T.
  • 雑誌名: FEBS Lett. 巻: 587 ページ: 2219-2225
  • DOI: 10.1016/j.febslet.2013.05.049
  • 査読あり
• [雑誌論文] Suppression of DS1 phosphatidic acid phosphatase confirms resistance to Ralstonia solanacearum in Nicotiana benthamiana. (2013)
  • 著者名/発表者名: Nakano M, Nishihara M, Yoshioka H, Takahashi H, Sawasaki T, Ohnishi K, Hikichi Y, Kiba A.
  • 雑誌名: PLoS One. 巻: 8 ページ: e75124
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0075124
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cell-free based protein array technology for analyses of protein kinases and ubiquitin ligases. (2013)
  • 著者名/発表者名: Sawasaki T, Takeda H, Takahashi H, Nemoto K.
  • 雑誌名: Seikagaku 巻: 85 ページ: 438-446
• [学会発表] 無細胞プロテインアレイを用いたプロテインキナーゼおよびユビキチンリガーゼの基質タンパク質探索技術 (2013)
  • 著者名/発表者名: 澤崎 達也, 根本 圭一郎, 高橋 宏隆, 竹田 浩之
  • 学会等名: 第86回日本生化学会大会
  • 発表場所: パシフィコ横浜
  • 年月日: 20130911-20130913
  • 招待講演
• [学会発表] コムギ無細胞蛋白質合成系を基盤とした膜タンパク質解析 (2013)
  • 著者名/発表者名: 澤崎 達也、竹田 浩之
  • 学会等名: 第65回日本細胞生物学会大会
  • 発表場所: ウインクあいち（愛知）
  • 年月日: 20130619-20130621
  • 招待講演
• [学会発表] コムギ無細胞蛋白質合成系を基盤とした膜蛋白質の合成・精製と細胞への導入技術 (2013)
  • 著者名/発表者名: 澤崎 達也, 竹田 浩之
  • 学会等名: 第65回日本細胞生物学会大会
  • 発表場所: ウインクあいち（愛知）
  • 年月日: 20130619-20130621
  • 招待講演
• [学会発表] 創薬等プラットフォームにおけるコムギ無細胞基盤膜蛋白質生産と高親和膜蛋白質抗体作成技術 (2013)
  • 著者名/発表者名: 澤崎 達也、竹田 浩之
  • 学会等名: 第13回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: とりぎん文化会館（鳥取）
  • 年月日: 20130612-20130614
  • 招待講演
• [学会発表] コムギ無細胞蛋白質合成技術と乳がんバイオマーカー探索
  • 著者名/発表者名: 澤崎 達也
  • 学会等名: 日本プロテオーム学会主催プロテオサイエンスセンター JHUPOサテライトジョイントシンポジウム
  • 発表場所: 愛媛大学総合情報メデイアセンター・メディアホール
  • 招待講演
• [備考] CELL-FREE Technology
  • URL: http://www.pros.ehime-u.ac.jp/cell-free/pg02.html