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2013 年度 実績報告書

新規高感度レポーター系を用いたrRNA遺伝子の種特異的転写開始機構の解析

公募研究

研究領域高精細アプローチで迫る転写サイクル機構の統一的理解
研究課題/領域番号 25118504
研究種目

新学術領域研究(研究領域提案型)

研究機関筑波大学

研究代表者

村野 健作  筑波大学, 医学医療系, 助教 (80535295)

研究期間 (年度) 2013-06-28 – 2015-03-31
キーワード転写 / RNAポリメラーゼI / 種特異性 / rRNA遺伝子
研究概要

インフルエンザウイルス由来のRNA依存性RNA polymerase(RdR Pol)を用いて、ヒトRNA polymerase I(Pol I)の活性を測定する新規PolIレポーター系の構築を行った。Pol Iレポーター系は、1,血清濃度依存性、2,転写因子UBFに対する応答性、3, アクチノマイシンDに対する感受性を示した。また既知の変異を保持するPol I promoter変異体ではレポーター活性が有意に減少した。ヒトrRNA遺伝子のpromoterを、マウスのものに置換することでマウスPol Iレポーター系も構築した。Pol IによるrRNA遺伝子の転写反応は厳格な種特異性を示す。すなわちヒトrRNA遺伝子はマウス細胞内で転写されない。構築した新規ヒトPol Iレポーター系は、ヒトの細胞であるHeLa細胞で機能し、マウスNIH3T3細胞では機能しなかった。逆にマウスPol Iレポーター系はNIH3T3細胞で機能し、HeLa細胞で機能しなかった。したがって、RdR Polをもちいた新規Pol Iレポーター系は、rRNA遺伝子に特徴的な種特異的転写反応を再現できた。
構築したヒトPol Iレポーター系を用いて、マウスNIH3T3細胞内でヒトSL1活性の再構築を行った。ヒトSL1を構成する4種類のTAFIをクローニングし、NIH3T3細胞にヒトPol Iレポーター系とともに導入したところ、ヒトrRNA遺伝子プロモーターからの転写反応を検出した。さらに詳細な解析の結果、マウス細胞内においてヒトrRNA遺伝子の転写反応を引き起こすには4種類のTAFIが必要十分であることが明らかとなった。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

平成25年度に計画した研究内容をほぼ計画通り遂行できたため。

今後の研究の推進方策

平成26年度に計画した以下の研究を進める。
1, ヒトHeLa細胞内でマウスTIF-IB活性の再構築を目指す。
2, 大腸菌やバキュロウイルスを用いて、SL1構成因子の組換えタンパク質を作製し、試験管内においてSL1活性の再構築を目指す。

  • 研究成果

    (5件)

すべて 2014 2013 その他

すべて 学会発表 (4件) 備考 (1件)

  • [学会発表] Overcoming the species-specific barrier in the rRNA gene transcription by reconstitution of complete SL1 complex2014

    • 著者名/発表者名
      Kensaku Murano, Mitsuru Okuwaki, and Kyosuke Nagata
    • 学会等名
      13th Asian Conference on Transcription
    • 発表場所
      メルボルン大学(オーストラリア)
    • 年月日
      20140219-20140221
  • [学会発表] rRNA遺伝子の種特異的転写機構の解析2013

    • 著者名/発表者名
      村野健作、永田恭介
    • 学会等名
      第36回日本分子生物学会年会
    • 発表場所
      神戸ポートアイランド(神戸)
    • 年月日
      20131203-20131206
  • [学会発表] M期リン酸化によるCTCFのDNA結合活性制御の解析2013

    • 著者名/発表者名
      関屋健史、村野健作、永田恭介
    • 学会等名
      第36回日本分子生物学会年会
    • 発表場所
      神戸ポートアイランド(神戸)
    • 年月日
      20131203-20131206
  • [学会発表] The Species-specific transcription mechanism of the rRNA gene revealed by a novel monitoring system using RNA-dependent RNA polymerase2013

    • 著者名/発表者名
      Kensaku Murano, Mitsuru Okuwaki, and Kyosuke Nagata
    • 学会等名
      転写サイクル合同班会議 2013
    • 発表場所
      ホテルおかだ(箱根)
    • 年月日
      20130805-20130807
  • [備考] 筑波大学大学院 感染生物学 分子ウイルス学分野

    • URL

      http://www.md.tsukuba.ac.jp/basic-med/infectionbiology/virology/

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公開日: 2015-05-28  

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