新奇Ｇサイクルの起動制御に関わる構造生物学的解析

2013 年度 実績報告書

• 研究領域: 細胞シグナリング複合体によるシグナル検知・伝達・応答の構造的基礎
• 研究課題/領域番号: 25121706
• 研究種目: 新学術領域研究(研究領域提案型)
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 堅田 利明 東京大学, 薬学研究科(研究院), 教授 (10088859)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: シグナル伝達 / 生体分子 / Ｇ蛋白質 / Ｇサイクル

研究概要

本新学術領域研究では、既知タイプとは異なる新奇低分子量Ｇ蛋白質群、すなわち、従来の刺激依存性GDP-GTP交換によるコンホメーション転換には依らないGTP結合待機型Ｇ蛋白質（RasファミリーのDi-Ras、Arfファミリーに属するArl8など）及び既知のＧドメインに加えて別の機能領域も有するユニークな構造のマルチ・ドメイン型Ｇ蛋白質（栄養感知からmTORへのシグナル伝達に介在するヘテロ二量体Ｇ蛋白質のRagなど）について、生化学、分子生物学、細胞生物学的な解析を進め、評価が可能となったＧ蛋白質複合体については構造学的な考察及び解析も加えた。１．H-、K-Rasなどの代表的なRasとは異なり、Di-Rasはその大部分がSmgGDSとヘテロ二量体を形成して細胞質の可溶性画分に存在した。SmgGDSはRhoAのグアニンヌクレオチド交換を促進する活性を有し、RhoAの活性化因子の一つと考えられている。そこで、SmgGDSがグアニンヌクレオチド結合状態に与える影響を検討した結果、RhoAに対する作用とは全く対照的に、SmGDSとの結合によってDi-Rasのグアニンヌクレオチド結合能が低下することを見出した。２．リソソームに局在するARL8が、GTP結合型（活性化型）において、HOPS複合体の構成因子VPS41と結合することを見出し、VPS41がARL8のエフェクターである可能性が示唆された。３．線虫のRag二量体をコードするraga-1及びragc-1両遺伝子の欠失変異体を用いた解析から、Ｇ蛋白質Ragが食餌中の必須アミノ酸に応答した神経前駆細胞の活性化に介在することを見出した。さらに、大腸菌の共発現系を用いて、点変異の導入等による組み換えヘテロ二量体（RagA-RagC）の精製系を構築し、ヘテロ二量体中の個々のRagＧサイクルに関わる動態評価を可能とした。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

Ｇ蛋白質複合体の高次構造決定に関わる研究の進展は、引き続く重要な課題であるが、本研究で対象とした新奇の低分子量Ｇ蛋白質群のいくつかについて、それらの新しい機能を見出した点は大きな進展である。特に、Di-Rasのユニークな生化学的性状解析の結果は、これまで単純化して考えられてきたRasファミリーのＧサイクルを再考する上で、意義深い研究成果と考えられる。また、Ragヘテロ二量体Ｇ蛋白質中の個々のRag-Ｇサイクルをモニター可能な評価系を構築したので、Ｇサイクルの存在様式が生理機能の発揮において果たす役割の解明に向けて貢献すると期待している。

今後の研究の推進方策

低分子量Ｇ蛋白質Di-RasがSmgGDSとヘテロ二量体を形成し、GTP/GDPとの結合親和性を低下させて細胞質画分に存在することは、ユニークな生化学的性状である。この特性を可能とする構造生物学的解析が、引き続く重要な課題の一つであり、構造生物学者との共同研究によって、その原子レベルでの解明を推進する。さらに、Di-RasはSmgGDSが解離することによってGTPの結合した活性型となり、細胞膜で機能するものと考えられるので、複合体の形成・解離を指標に、このＧサイクルを始動させる新たな因子群の同定も進める。他方、リソソームと後期エンドソーム、ファゴソームとの融合過程に関与するArfファミリーＧ蛋白質ARL8のエフェクターとして、HOPS複合体の構成因子であるVPS41を見出したので、その複合体の構造生物学的な解析にも着手する。

研究成果

• [雑誌論文] Active transport and diffusion barriers restrict Joubert Syndrome-associated ARL13B/ARL-13 to an Inv-like ciliary membrane subdomain. (2013)
  • 著者名/発表者名: Cevik S, Sanders AA, Van Wijk E, Boldt K, Clarke L, van Reeuwijk J, Hori Y, Horn N, Hetterschijt L, Wdowicz A, Mullins A, Kida K, Kaplan OI, van Beersum SE, Man Wu K, Letteboer SJ, Mans DA, Katada T, Kontani K, Ueffing M, Roepman R, Kremer H, Blacque OE.
  • 雑誌名: PLoS Genet. 巻: 9 ページ: -
  • DOI: 10.1371/journal.pgen.1003977
  • 査読あり
• [雑誌論文] Genetically encoded calcium indicator illuminates calcium dynamics in primary cilia. (2013)
  • 著者名/発表者名: Su S, Phua SC, Derose R, Chiba S, Narita K, Kalugin PN, Katada T, Kontani K, Takeda S, Inoue T.
  • 雑誌名: Nat. Methods 巻: 10 ページ: 1105-1107
  • DOI: 10.1038/nmeth.2647
  • 査読あり
• [雑誌論文] The microRNA miR-235 couples blast-cell quiescence to the nutritional state. (2013)
  • 著者名/発表者名: Kasuga H, Fukuyama M, Kitazawa A, Kontani K, Katada T.
  • 雑誌名: Nature 巻: 497 ページ: 503-506
  • DOI: 10.1038/nature12117
  • 査読あり
• [雑誌論文] Arl8/ARL-8 functions in apoptotic cell removal by mediating phagolysosome formation in C. elegans. (2013)
  • 著者名/発表者名: Sasaki A, Nakae I, Nagasawa M, Hashimoto K, Abe F, Saito K, Fukuyama M, Gengyo-Ando K, Mitani S, Katada T, Kontani K.
  • 雑誌名: Mol. Biol. Cell 巻: 24 ページ: 1584-1592
  • DOI: 10.1091/mbc.E12-08-0628
  • 査読あり
• [学会発表] ARL8 mediates phagolysosome formation for apoptotic cell clearance in C. elegans.
  • 著者名/発表者名: Kontani K, Sasaki A, Hashimoto K, Gengyo-Ando K, Mitani S, Katada T.
  • 学会等名: FASEB Summer Research Conferences: ARF and Rab family G Proteins.
  • 発表場所: Snowmass, U.S.A.
  • 招待講演
• [学会発表] The tight regulation of Sar1 GTPase cycle is necessary for collagen secretion.
  • 著者名/発表者名: Saito K, Yamashiro K, Shimazu N, Tanabe T, Katada T.
  • 学会等名: Gordon Research Conferences, Molecular Membrane Biology.
  • 発表場所: Andover, U.S.A.
• [学会発表] C. elegans Rag genes are involved in endosome / lysosome biogenesis in a TORC1-independent fashion.
  • 著者名/発表者名: Iki K, Ito Y, Shimomura Y, Kajiho H, Fukuyama M, Kontani K, Katada T.
  • 学会等名: 19th International C. elegans Meeting.
  • 発表場所: Los Angeles, U.S.A.
• [学会発表] リソソームへの物質輸送に介在する低分子量Gタンパク質ARL8
  • 著者名/発表者名: 紺谷圏二
  • 学会等名: 細胞内ロジスティクス・シンポジウム
  • 発表場所: 淡路夢舞台国際会議場（兵庫県・淡路市）
• [学会発表] 小胞体からのコラーゲン分泌機構の解明
  • 著者名/発表者名: 齋藤康太、堅田利明.
  • 学会等名: 細胞内ロジスティクス・シンポジウム
  • 発表場所: 淡路夢舞台国際会議場（兵庫県・淡路市）
• [学会発表] リソソームへの物質輸送に介在する低分子量Gタンパク質ARL8
  • 著者名/発表者名: 紺谷圏二、佐々木文佳、堅田利明.
  • 学会等名: 第8回トランスポーター研究会
  • 発表場所: 熊本大学（熊本県・熊本市）
  • 招待講演
• [備考] 東京大学・大学院薬学系研究科 生理化学教室ホームページ
  • URL: http://www.f.u-tokyo.ac.jp/~seiri/