| 研究実績の概要 |
パスツレラ毒素活性ドメインとヘテロ三量体Giαの複合体の構造解析
パスツレラ毒素は皮膚壊死毒素であり、細胞に作用してヘテロ三量体GTPaseのGqおよびG12/13依存性のシグナル伝達系を恒常的に活性化する。本計画研究の具体的な項目は、PMTの活性ドメイン(C-PMT)とその細胞内標的分子であるヘテロ三量体GTPaseのαサブユニット（Giα）との複合体の立体構造解析によるシグナル伝達活性化メカニズムの構造生物学的理解である。これによって、パスツレラ毒素によるシグナル伝達系を活性化する反応機構について詳細な知見が得られ、GTPase活性化機構の理解や新規なGTPase阻害薬の開発に関する構造的基盤を提供する。
C-PMTおよびその不活型変異体並びにGiαについて大腸菌での発現精製を行った。Giαの蛋白質精製についてはGi2αから、高発現系のGi3αを用いることで大量精製が可能となり、結晶化に用いるサンプル精製の効率が飛躍的に上がった。これらの精製標品を用いてC-PMTとGi3αの共結晶化を行ったところ、数種類の条件で結晶が得られた。この内の数種類の結晶についてはX線回折実験を行い、構造決定を行ったが、いずれもC-PMT分子のみを含んだ結晶であり、複合体の形成を確認できなかった。今後、更に結晶化条件の精密化(タンパク質濃度、添加剤スクリーニング)を行い、作成した複合体結晶を用いてX線回折実験を行う。C-PMTとGi3αそれぞれの構造は既に明らかになっている(PDB ID: 2EBF,1ZCB)。複合体結晶を用いて高分解能の回折データが得られれば、これらの分子をモデルとして、分子置換法を用いて位相決定し、立体構造を決定する。
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