染色体構造変化がもたらす持続的VCAM-1遺伝子発現機構解析

2013 年度 実績報告書

• 研究領域: ゲノムアダプテーションのシステム的理解
• 研究課題/領域番号: 25125707
• 研究種目: 新学術領域研究(研究領域提案型)
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 神吉 康晴 東京大学, アイソトープ総合センター, 助教 (00534869)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: 染色体立体構造 / ChIA-PET / ChIP-seq / miRNA / 動脈硬化 / VCAM-1 / TNFa / IL4

研究概要

本研究は、動脈硬化にとって重要な遺伝子VCAM1 (Vascular Cell Adhesion Molecule-1）の持続的な発現誘導に関与する非翻訳RNAと染色体立体構造を解き明かすことが目的である。この目的のために、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVECs）にTNF-a (Tumor Necrosis Factor-a）を作用させてVCAM-1を発現させる系を用いた。
まず、HUVECsにTNF-aを作用させた際の染色体立体構造解析として、ChIA-PET（Chromatin Interaction Analysis by Pair-End Tag Sequencing）法を行った。ChIA-PET法は次世代シークエンサーを用いるが、そのデータの解析において、異なる染色体間での相互作用を見出すことがこれまで困難であった。本年度はまず、上記ChIA-PET法の新しい解析アルゴリズムを作り、その妥当性を検証した。
また、同時に着目している非翻訳RNAに関しては、HUVECsにTNF-aを作用させた際のmiRNAアレイを行い、有意に発現の変動するmiRNAを抽出した。これまでに我々は、TNF-aのみならずIL-4もVCAM-1を誘導させることを報告しており、本年度は両方の刺激で共通して変動するmiRNAを同定した。
上記で見出したmiRNAに対して、その過剰発現系を用いたin vitro, in vivoの実験により、VCAM-1の発現や単球の接着を抑制し、動脈硬化巣を小さくする効果が得られることが分かった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

予定では、初年度はHUVECsにTNFaを作用させた際のChIA-PET解析、転写因子p65のChIP-seq解析を行い、その結果からVCAM-1の誘導に働く有効なエンハンサー領域を同定することであった。これまでにChIA-PET、p65のChIP-seqは既にデータを取得しており、現在はその解析からエンハンサー領域を探索しているところである。それに加えて、初年度はHUVECsにTNFaを作用させた際に変動するmiRNAの抽出に成功している。このmiRNAによりp65の転写が抑制されることも既に見出していることから、これまでの計画は概ね順調といえる。

今後の研究の推進方策

平成26年度は、（１）これまでに見出しているmiRNAのVCAM-1発現、動脈硬化に与える影響をin vivoで確認すること、（２）染色体立体構造解析とmiRNAアレイの解析を合わせることで、立体構造を形成するのに必要なmiRNAを同定すること、この2点を行う。
（１）TNF-aで発現が変動するmiRNAが、実際に動脈硬化を抑制する効果があるかどうかを確認するために、内皮細胞特異的にmiRNAを発現させるconditional knockinマウスを作製する。このマウスとApoEノックアウトマウスを交配させることで、動脈硬化巣に与えるmiRNAの効果を検証する。
（２）これまでに我々は一部のmiRNAが転写ファクトリーの中に存在し、転写に抑制的に寄与していることを報告してきた。本年度は、VCAM-1の発現を抑制している染色体立体構造を同定し、その中にmiRNAが含まれているかどうかを3D-FISH法で検証する。

研究成果

• [雑誌論文] Direct evidence for pitavastatin induced chromatin structure change in the KLF4 gene in endothelial cells. (2014)
  • 著者名/発表者名: Maejima T, Inoue T, Kanki Y,,,,, Kodama T, Wada Y
  • 雑誌名: Plos One 巻: in press ページ: in press
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cross-enhancement of ANGPTL4 transcription by HIF1 alpha and PPAR beta/delta is the result of the conformational proximity of two response elements. (2014)
  • 著者名/発表者名: Inoue T, Kohro T, Tanaka T, Kanki Y, Li G, Poh HM, Mimura I, Kobayashi M, Taguchi A, Maejima T, Suehiro JI, Sugiyama A, Kaneki K, Aruga H, Dong S, Stevens JF, Yamamoto S, Tsutsumi S, Fujita T, Ruan X, Aburatani H, Nangaku M, Ruan Y, Kodama T, Wada Y.
  • 雑誌名: Genome Biology 巻: in press ページ: in press
  • 査読あり
• [雑誌論文] Revolution of nephrology research by deep sequencing: ChIP-seq and RNA-seq. (2014)
  • 著者名/発表者名: Mimura I, Kanki Y, Kodama T, Nangaku M.
  • 雑誌名: Kidney International 巻: 85(1) ページ: 31-8
  • DOI: 10.1038/ki.2013.321.
  • 査読あり
• [雑誌論文] GATA factor switching from GATA2 to GATA1 contributes to erythroid differentiation. (2013)
  • 著者名/発表者名: Suzuki M, Kobayashi-Osaki M, Tsutsumi S, Pan X, Ohmori S, Takai J, Moriguchi T, Ohneda O, Ohneda K, Shimizu R, Kanki Y, Kodama T, Aburatani H, Yamamoto M.
  • 雑誌名: Genes to Cells 巻: 18(11) ページ: 921-33
  • DOI: 10.1111/gtc.12086.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Inhibition of histone demethylase JMJD1A improves anti-angiogenic therapy and reduces tumor-associated macrophages. (2013)
  • 著者名/発表者名: Osawa T, Tsuchida R, Muramatsu M, Shimamura T, Wang F, Suehiro J, Kanki Y, Wada Y, Yuasa Y, Aburatani H, Miyano S, Minami T, Kodama T, Shibuya M.
  • 雑誌名: Cancer Research 巻: 73(10) ページ: 3019-28
  • DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-12-3231.
  • 査読あり
• [学会発表] エピゲノム制御からの 新規血管新生因子の同定 (2014)
  • 著者名/発表者名: 神吉康晴
  • 学会等名: 第2回生活習慣病の分子細胞病態学研究会
  • 発表場所: ホテル椿山荘東京、東京都、日本
  • 年月日: 20140315-20140315
• [学会発表] 染色体立体構造網羅解析からの細胞特異性解読へのアプローチ (2014)
  • 著者名/発表者名: 神吉康晴
  • 学会等名: 京都大学再生医科学研究所平成25年度共同研究報告会
  • 発表場所: 京都大学再生医科学研究所、京都市、日本
  • 年月日: 20140312-20140312
  • 招待講演
• [学会発表] A novel epigenetic mechanism revealed tumor associated angiogenesis (2013)
  • 著者名/発表者名: Yasuharu Kanki, Jun-ichi Suehiro, Tsuyoshi Osawa, Imari Mimura, Youichiro Wada, Hiroyuki Aburatani, Tatsuhiko Kodama, Takashi Minami
  • 学会等名: 第72回日本癌学会学術総会
  • 発表場所: パシフィコ横浜、横浜市、日本
  • 年月日: 20131003-20131005
• [学会発表] Transcription factor GATA2 is indispensable for the differentiation and maintenance of vascular endothelial cells (2013)
  • 著者名/発表者名: 神吉康晴、興梠貴英、堤修一、三村維真理、松永太一、山水康平、片山志織、油谷浩幸、児玉龍彦、和田洋一郎、山下潤、南敬
  • 学会等名: 第86回日本生化学会大会
  • 発表場所: パシフィコ横浜、横浜市、日本
  • 年月日: 20130911-20130913
• [学会発表] Transcription factor GATA2 is indispensable for the differentiation and maintenance of vascular endothelial cells (2013)
  • 著者名/発表者名: Yasuharu Kanki, Taichi Matsunaga, Hiroyuki Aburatani, Youichiro Wada, Tatsuhiko Kodama, Jun Yamashita, Takashi Minami
  • 学会等名: The 11th Japan-Korea Joint Symposium on Vascular Biology
  • 発表場所: Hyatt Regency jeju Hotel, Jeju Island, Korea
  • 年月日: 20130821-20130824
• [図書] 血管医学 (2013)
  • 著者名/発表者名: 神吉康晴
  • 総ページ数: 9
  • 出版者: メディカルレビュー社