Ｇｅｍｉｎｉｎ発現量を標的とした白血病幹細胞制御法の開発への基盤研究

2013 年度 実績報告書

• 研究領域: 癌幹細胞を標的とする腫瘍根絶技術の新構築
• 研究課題/領域番号: 25130708
• 研究種目: 新学術領域研究(研究領域提案型)
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 安永 晋一郎 広島大学, 原爆放射線医科学研究所, 准教授 (50336111)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: 白血病幹細胞 / 造血幹細胞 / 自己複製 / 分化誘導 / 細胞周期 / ＤＮＡ複製クロマチンリモデリング / クロマチンリモデリング / Geminin

研究概要

平成２５年度の本研究において助成金を受け、Gemininの発現を可視化することのできるGeminin-EYFPノックインマウスの骨髄細胞を用いた様々な血液学的解析方法を確立した。特に、造血幹細胞分画であるCD34-KSL （c-Kit+Sca1+Lin-）細胞の中にGeminin-high細胞群を見つけ、その細胞の中には致死的放射線照射を施したマウスに移植すると長期骨髄再構築能を示す細胞が存在することを明らかにし、このノックインマウスを使うことで自己複製中の造血幹細胞を同定することが可能であることを示した。この実験系は、自己複製中の白血病幹細胞の同定にも使用できるものと考えられる。また、MLL-AF9、Hoxa9 (+Meis1a)、BCR-ABLなどマウスに実験的白血病を引き起こすことのできる遺伝子群を、各種赤色蛍光（RFP; DsRed Express2、tandem Tomato (tdTomato)、humanized Kusabira Orange (hKO)など）をマーカーに持ったレトロウイルスベクターにつなぎ、従来使用していたGFPマーカーと異なりノックインマウスのEYFPと容易に区別が可能なRFPをマーカーとして持った白血病細胞及び白血病幹細胞をGeminin-EYFPノックインマウス由来の骨髄細胞から作製することが可能になり、白血病幹細胞におけるGemininの発現動態を詳細に解析できるようになった。また、ヒト白血病幹細胞の活性解析を行うために免疫不全（BRGS）マウス九州大学より入手し、その繁殖に取りかかった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

上記のごとくGeminin-EYFPノックインマウスを用いたRFPをマーカーとしたマウス実験白血病モデル系を確立し、Gemininの発現動態と白血病幹細胞活性との相関を詳細に解析する実験系を確立することができた。しかしながら、MLL-AF9、Hoxa9 (+Meis1a)を導入して白血病を発症させ、充分な再現性のあるデーターを回収するには至っていないから。

今後の研究の推進方策

引き続き、　MLL-AF9、Hoxa9 (+Meis1a)を導入して白血病を発症させ、再現性のあるデーターの回収に努める。
BCR-ABLを導入した細胞を移植した一次レシピエントマウスが、骨髄増殖性疾患を発症した後、イマチニブを２週間投与し寛解に導入する。この寛解導入マウスの白血病幹細胞分画（KSL分画）にある細胞をGeminin-EYFPの発現強度により亜分画に分け二次レシピエントに移植し再発率を見ることで、白血病幹細胞を静止期に留め置きイマチニブ耐性白血病幹細胞を維持するために最適なGemininの発現量を同定する。また、この寛解導入マウスの骨髄細胞の白血病幹細胞分画におけるGemininの発現量を、レトロウイルスベクターを用いて操作し二次レシピエントに移植し再発率の変化を見ることで、Gemininタンパク質発現量と白血病幹細胞のイマチニブ耐性との関係を明らかにする。
レトロウイルスベクター系と同様にGemininの発現を操作できるレンチウイルスベクター系を確立させる。次いで、患者由来のヒト白血病細胞におけるGemininの発現を操作し免疫不全（BRGS）マウスに移植して、マウス実験白血病モデルで確かめられたのと同様に、白血病幹細胞の活性を制御することができるかを検討する。

研究成果

• [雑誌論文] Transcription of the Geminin gene is regulated by a negative-feedback loop. (2014)
  • 著者名/発表者名: Ohno, Y., Saeki, K., Yasunaga, S., Kurogi. T., Suzuki-Takedachi, K., Shirai, M., Mihara K., Yoshida, K., Voncken J. W, Ohtsubo, M. & Takihara Y.
  • 雑誌名: Mol. Biol. Cell 巻: 25(8) ページ: 1374-1383
  • DOI: doi: 10.1091/mbc.E13-09-0534.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Simple diagnosis of STAT1 gain-of-function alleles in patients with chronic mucocutaneous candidiasis. (2014)
  • 著者名/発表者名: 35. Mizoguchi Y., Tsumura M., Okada S., Hirata O., Minegishi S., Imai K., Hyakuna N., Muramatsu H.,. Kojima S., Ozaki Y., Imai T., Takeda S., Okazaki T., Ito T, Yasunaga S., Takihara Y., Bryant V.L., Kong X.F., Cypowyj S., Boisson-Dupuis S., Puel A., Casanova J.L., Morio T. & Kobayashi M.
  • 雑誌名: J. Leukoc. Biol. 巻: 95 (4) ページ: 667-676
  • DOI: doi: 10.1189/jlb.0513250. Epub 2013 Dec 16.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Scmh1 has E3 ubiquitin ligase activity for Geminin and histone H2A and regulates Geminin stability directly or indirectly via transcription repression of Hoxa9 and Hoxb4. (2013)
  • 著者名/発表者名: Yasunaga, S., Ohtsubo, M., Ohno, Y., Saeki, K., Kurogi. T., Tanaka-Okamoto, M., Ishizaki, H., Shirai, M., Mihara, K., Brock, H. W., Miyoshi, J. & Takihara Y.
  • 雑誌名: Mol. Cell. Biol. 巻: 33 (4) ページ: 644-660
  • DOI: doi: 10.1128/MCB.00974-12. Epub 2012 Dec 3.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Hoxa9 transduction induces hematopoietic stem and progenitor cell activity through the direct down-regulation of Geminin protein. (2013)
  • 著者名/発表者名: Ohno, Y., Yasunaga, S., Janmohamed, S., Ohtsubo, M., Saeki, K., Kurogi. T., Mihara, K., Iscove, N. N. & Takihara Y.
  • 雑誌名: PLoS ONE 巻: 8 (1) ページ: e53161
  • DOI: doi: 10.1371/journal.pone.0053161. Epub 2013 Jan 11.
  • 査読あり
• [学会発表] Negative feed-back loop regulates E2F-mediated transcriptional activation of the Geminin gene (2013)
  • 著者名/発表者名: Kurogi T., Ohno Y., Yasunaga S., Suzuki-Takedachi K., Shirai M., Ohtsubo M., Takihara Y.
  • 学会等名: The 36th Annual Meeting of the Molecular Biology of Japan
  • 発表場所: Kobe, Japan
  • 年月日: 20131203-20131206
• [学会発表] Molecular analysis of a role for Geminin in regulating proliferation and differentiation of hematopoietic stem/progenitor cells by visualizing Geminin expression (2013)
  • 著者名/発表者名: Suzuki-Takedachi K., Yasunaga S., Ohno Y., Kurogi T., Ohtsubo M., Takihara Y.
  • 学会等名: he 36th Annual Meeting of the Molecular Biology of Japan
  • 発表場所: Kobe, Japan
  • 年月日: 20131203-20131206
• [学会発表] Molecular role for Geminin in switching self-renewal and differentiation of hematopoietic cells (2013)
  • 著者名/発表者名: Yasunaga S., Ohno Y., Kurogi T., Suzuki-Takedachi K., Nakashima Y., Ohtsubo M., Takihara Y.
  • 学会等名: The 75th Annual Meeting of the Japanese Society of Hematology
  • 発表場所: Sapporo, Japan
  • 年月日: 20131011-20131013
• [学会発表] Negative feed-back loop regulates transcription of the Geminin gene, which governs HSC activity (2013)
  • 著者名/発表者名: Ohno Y., Yasunaga S., Kurogi T., Suzuki-Takedachi K., Nakashima Y., Ohtsubo M., Takihara Y.
  • 学会等名: The 75th Annual Meeting of the Japanese Society of Hematology
  • 発表場所: Sapporo, Japan
  • 年月日: 20131011-20131013
• [学会発表] Expression and molecular function of Geminin, which governs hematopoietic stem cell activity (2013)
  • 著者名/発表者名: Takihara Y., Yasunaga S., Ohno Y., Kurogi T., Suzuki-Takedachi K., Nakashima Y., Ohtsubo M.
  • 学会等名: 第８６回日本生化学会大会
  • 発表場所: Yokohama, Japan
  • 年月日: 20130911-20130913
  • 招待講演
• [学会発表] Visualization and functional analysis of Geminin, a candidate molecule governing self-renewal and cellular differentiation of hematopoietic stem cells (2013)
  • 著者名/発表者名: Yasunaga S., Ohno Y., Kurogi T., Saeki K., Nakashima Y., Ohtsubo M., Takihara Y.
  • 学会等名: The 11th Stem Cell Research Symposium
  • 発表場所: Tokyo, Japan
  • 年月日: 20130517-20130518
• [学会発表] E2F-mediated transcriptional activation of the Geminin gene is under the regulation of a negative-feedback loop (2013)
  • 著者名/発表者名: Ohno Y., Saeki K., Yasunaga S., Shirai M., , Kurogi T., Nakashima Y., Ohtsubo M., Takihara Y.
  • 学会等名: The 11th Stem Cell Research Symposium
  • 発表場所: Tokyo, Japan
  • 年月日: 20130517-20130517
• [備考] 幹細胞機能学ホームページ
  • URL: http://home.hiroshima-u.ac.jp/dscb