公募研究
平成26年度も平成25年度に引き継ぎ、①SERCA2a/PLN複合体を制御する因子群の大量発現系の構築と、②PLNとSLNの単体の発現系の構築、に取り組んだ。①に関してはS100A1、calreticulin、HAX1、HRCの4分子を最初のターゲットとし、平成25年度に大腸菌での発現系の構築を試みたが、S100A1以外の分子での構築は不可能であった。そこで、平成26年度はSf9/バキュロウィルス発現系での発現を試みたところ、calreticulin、HRCの発現に成功した。そこで、前述のS100A1、calreticulinとHRCのタグによる精製を試みた。その結果、どれも純度90%程度で精製することに成功した。だが、SERCA2a/PLN複合体との再構成実験や制御因子群単体の結晶化には更なる精製が必要である。そこでイオン交換カラムでの2段階目の精製を試みた。その結果、95%以上の純度でそれぞれの蛋白を精製することに成功した。今後②のSERCA2a/PLN複合体との再構成に成功したならば、活性測定等の実験を行う予定である。また、制御因子単体での結晶化にも取り組むと共に、複合体での結晶化も目指す。HAX1については引き続き発現系の構築に取り組んでいるが、スモールスケールでの発現には成功した。今後、大量発現へスケールアップすると共に、精製系の構築を行う予定である。②に関しては、アデノウィルス/哺乳類培養細胞発現系により、PLNの野生型を含めて3種類のPLNとSLNの発現・精製系の構築を試み、これに成功した。現在、精製SERCA2aを混ぜ合わせ、脂質2重膜への再構成を試みている最中である。
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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J. Biol. Chem.
巻: 290 ページ: 4829-4842
10.1074/jbc.M114.611384
