酵素反応追跡のためのピコリットルインクジェットによる新規高速混合器の試作

2014 年度 実績報告書

• 研究領域: 理論と実験の協奏による柔らかな分子系の機能の科学
• 研究課題/領域番号: 26104532
• 研究機関: 兵庫県立大学
• 研究代表者: 小倉 尚志 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 教授 (70183770)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: 酵素 / 機能メカニズム / 高速混合器 / インクジェットヘッド / 振動分光 / 反応ダイナミクス

研究実績の概要

いかなる生命現象も突き詰めるとタンパク質が駆動する化学反応がもとになっている。したがって、生命とは何か？という問いに答えるためには、タンパク質の機能メカニズムを明らかにする必要がある。この目的のためにはタンパク質の立体構造とダイナミクスの情報が不可欠である。本研究の目的は、タンパク質の構造ダイナミクスを研究するための微量高速混合装置の試作である。構想では、２つのインクジェットヘッドから高速（1～10 m/s）で吐出される微量（100 pL～1 nL）の酵素および基質をそれぞれ含む液滴を衝突させることによって混合し、酵素反応を開始させて時間軸に沿って追跡する。
平成２６年度は、１台のインクジェットヘッド（ノズル径80 μm）を用いて500 Hzで液滴を吐出し、同期させたLED光源によりメトミオグロビン（濃度0.2 mM）の可視吸収スペクトルの測定を行った。まず、ピエゾ式インクジェットヘッドに印加する駆動パルスの条件を決定した。その条件のもと、インクジェットヘッドから吐出されるミオグロビン水溶液の液滴は体積533±17 pLであり、直径100 μmであった。
測定時間0.9 sで測定した吸収スペクトルは通常のセルを用いた測定結果と基本的に一致した。この時、必要な試料の体積は225 nLであり、ミオグロビンの量は45 pmoleであった。したがって、２つの液滴を衝突させて混合し、酵素反応を追跡する混合器を試作する準備が整った。また、ヘッドが詰まった時の対処法のノウハウが蓄積された。このことは今後の本法の発展のために重要である。なお、液滴そのもので吸収スペクトルが精度良く測定できたため、当初計画した「トランジットセル」の開発は現時点では行わなかった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

ミオグロビン水溶液（0.2 mM）の液滴をインクジェットノズルで吐出する駆動条件（駆動パルス電圧、パルス幅、繰り返し周波数）を決定した。500 Hzで吐出される液滴の速度は1 m/sであり、直径は100 μm、体積は533±17 pLであった。500 Hzで吐出される液滴に空間的かつ時間的に同期させたLED光源のパルス光により、吸収スペクトルを測定した。0.9 sの積算に必要な液滴の合計体積は225 nLであり、ミオグロビン量は45 pmoleであった。得られた吸収スペクトルは、通常のキュベットを用いて市販の分光光度計で測定した吸収スペクトルと基本的に一致した。以上のことから、２つの液滴を衝突させて混合し酵素反応を開始させるタイプの微量高速混合装置を試作する準備が整った。以上の結果から「おおむね順調に進展している」と判断した。なお、液滴そのもので質の高いスペクトルが得られたため、当初計画した「トランジットセル」の開発は現時点では行わなかった。

今後の研究の推進方策

２台目のインクジェット吐出実験キットを購入し、現有装置と合わせて、２つの液滴を衝突させることによって混合し、速い酵素反応を追跡可能な微量高速混合器を試作する。混合のデッドタイムは100 μmを目標にする。試作品を用いて、酵素反応を吸収分光法、共鳴ラマン分光法、赤外分光法などにより追跡する実証を行う。

研究成果

• [雑誌論文] Higd1a is a positive regulator of cytochrome c oxidase (2015)
  • 著者名/発表者名: T. Hayashi, Y. Asano, Y. Shintani, H. Aoyama, H. Kioka, O. Tsukamoto, M. Hikita, K. Shinzawa-Itoh, K. Takafuji, S. Higo, H. Kato, S. Yamazaki, K. Matsuoka, A. Nakano, H. Asanuma, M. Asakura, T. Minamino, Y. Goto, T. Ogura, M. Kitakaze, I. Komuro, Y. Sakata, T. Tsukihara, S. Yoshikawa, S. Takashima
  • 雑誌名: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 巻: 112 ページ: 1553-1558
  • DOI: 10.1073/pnas.1419767112
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Formation and characterization of a reactive chromium(v)-oxo complex: mechanistic insight into hydrogen-atom transfer reactions (2015)
  • 著者名/発表者名: H. Kotani, S. Kaida, T. Ishizuka, M. Sakaguchi, T. Ogura, Y. Shiota, K. Yoshizawa, T. Kojima
  • 雑誌名: Chem. Sci. 巻: 6 ページ: 945-955
  • DOI: 10.1039/c4sc02285h
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Infrared and Raman spectroscopic investigation of the reaction mechanism of cytochrome c oxidase (2015)
  • 著者名/発表者名: S. Nakashima, T. Ogura, T. Kitagawa
  • 雑誌名: Biochim. Biophys. Acta 巻: 1847 ページ: 86-97
  • DOI: 10.1016/j.bbabio.2014.08.002
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Effects of proton motive force on the structure and dynamics of bovine cytochrome c oxidase in phospholipid vesicles (2014)
  • 著者名/発表者名: T. Nomura, S. Yanagisawa, K. Shinzawa-Itoh, S. Yoshikawa, T. Ogura
  • 雑誌名: Biochemistry 巻: 53 ページ: 6382-6391
  • DOI: 10.1021/bi501022j
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Influence of ligand flexibility on the electronic structure of oxidized Ni(III)-phenoxide complexes (2014)
  • 著者名/発表者名: M. Kawai, T. Yamaguchi, S. Masaoka, F. Tani, T. Kohzuma, L. Chiang, T. Storr, K. Mieda, T. Ogura, R. K. Szilagyi, Y. Shimazaki
  • 雑誌名: Inorg. Chem. 巻: 53 ページ: 10195-10202
  • DOI: 10.1021/ic501181k
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Electronic control of ligand-binding preference of a myoglobin mutant (2014)
  • 著者名/発表者名: R. Nishimura, D. Matsumoto, T. Shibata, S. Yanagisawa, T. Ogura, H. Tai, T. Matsuo, S. Hirota, S. Neya, A. Suzuki, Y. Yamamoto
  • 雑誌名: Inorg. Chem. 巻: 53 ページ: 9156-9165
  • DOI: 10.1021/ic5011924
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Geometric control of nuclearity in copper(I)/dioxygen chemistry (2014)
  • 著者名/発表者名: T. Abe, Y. Morimoto, T. Tano, K. Mieda, H. Sugimoto, N. Fujieda, T. Ogura, S. Itoh
  • 雑誌名: Inorg. Chem. 巻: 53 ページ: 8786-8794
  • DOI: 10.1021/ic501461n
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Effect of the Electron Density of the Heme Fe Atom on the Fe-Histidine Coordination Bond in Deoxy Myoglobin (2014)
  • 著者名/発表者名: R. Nishimura, T. Shibata, H. Tai, I. Ishigami, S. Yanagisawa, T. Ogura, S. Neya, A. Suzuki, Y. Yamamoto
  • 雑誌名: Bull. Chem. Soc. Jpn. 巻: 87 ページ: 905-911
  • DOI: 10.1246/bcsj.20130331
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Determination of damage-free crystal structure of an X-ray-sensitive protein using an XFEL (2014)
  • 著者名/発表者名: K. Hirata, K. Shinzawa-Itoh, N. Yano, S. Takemura, K. Kato, M. Hatanaka, K. Muramoto, T. Kawahara, T. Tsukihara, E. Yamashita, K. Tono, G. Ueno, T. Hikima, H. Murakami, Y. Inubushi, M. Yabashi, T. Ishikawa, M. Yamamoto, T. Ogura, H. Sugimoto, J. R. Shen, S. Yoshikawa, H. Ago
  • 雑誌名: Nat. Methods 巻: 11 ページ: 734-736
  • DOI: 10.1038/nmeth.2962
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Highly reactive nonheme iron(III) iodosylarene complexes in alkane hydroxylation and sulfoxidation reactions (2014)
  • 著者名/発表者名: S. Hong, B. Wang, M. S. Seo, Y. M. Lee, M. J. Kim, H. R. Kim, T. Ogura, R. Garcia-Serres, M. Clemancey, J. M. Latour, W. Nam
  • 雑誌名: Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 巻: 53 ページ: 6388-6392
  • DOI: 10.1002/anie.201402537
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [学会発表] チトクロムc酸化酵素の反応初期過程の研究 (2015)
  • 著者名/発表者名: 西口達人, 李 辰, 伊藤‐新澤恭子, 吉川信也, 中島 聡, 小倉尚志
  • 学会等名: 日本化学会第95回春季年会
  • 発表場所: 日本大学理工学部船橋キャンパス/薬学部（千葉県船橋市習志野台7-24-1）
  • 年月日: 2015-03-26 – 2015-03-29
• [学会発表] 時間分解共鳴ラマン分光法によるチトクロムc酸化酵素の反応ダイナミクスの研究 (2015)
  • 著者名/発表者名: 中川善之, 伊藤-新澤恭子, 吉川信也, 中島 聡, 小倉尚志
  • 学会等名: 日本化学会第95回春季年会
  • 発表場所: 日本大学理工学部船橋キャンパス/薬学部（千葉県船橋市習志野台7-24-1）
  • 年月日: 2015-03-26 – 2015-03-29
• [学会発表] ハチ毒メリチンの細胞毒性に関与する中性脂質膜中における会合体形成過程の分光学的解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 神田直樹, 栁澤幸子, 小倉尚志, 辻 暁
  • 学会等名: 日本化学会第95回春季年会
  • 発表場所: 日本大学理工学部船橋キャンパス/薬学部（千葉県船橋市習志野台7-24-1）
  • 年月日: 2015-03-26 – 2015-03-29
• [学会発表] ストップトフロー共鳴ラマン分光法によるミオグロビンヘム近傍構造変化の追跡 (2015)
  • 著者名/発表者名: 栁澤幸子, デシュパンデ メガ スブハシュ, 廣田 俊, 中川逹央, 小倉 尚志
  • 学会等名: 日本化学会第95回春季年会
  • 発表場所: 日本大学理工学部船橋キャンパス/薬学部（千葉県船橋市習志野台7-24-1）
  • 年月日: 2015-03-26 – 2015-03-29
• [学会発表] 金属中心-タンパク質間の情報伝達ダイナミクス：赤外分光法による検出 (2015)
  • 著者名/発表者名: 小倉尚志
  • 学会等名: 分子研研究会「生物無機化学の最先端と今後の展望：金属と生体分子の作用機序解明とモデル化および応用への展開」
  • 発表場所: 分子科学研究所 岡崎コンファレンスセンター（愛知県岡崎市明大寺町字西郷中38）
  • 年月日: 2015-01-06 – 2015-01-07
  • 招待講演
• [学会発表] Vibrational Spectroscopic Investigation of Molecular Mechanisms of Aerobic Respiration (2014)
  • 著者名/発表者名: T. Ogura
  • 学会等名: Advances in Live Single-Cell Thermal Imaging and Manipulation
  • 発表場所: 沖縄科学技術大学院大学シーサイドハウス(OIST)（沖縄県国頭郡恩納村字谷茶1919-1）
  • 年月日: 2014-11-10 – 2014-11-12
  • 招待講演
• [学会発表] X線回折計と共存した同軸・同時可視吸収分光装置の開発 (2014)
  • 著者名/発表者名: 坂口美幸, 木村哲就, 上野 剛, 城 宜嗣, 小倉尚志, 久保 稔
  • 学会等名: 平成26年度日本結晶学会年会
  • 発表場所: 東京大学農学部（東京都文京区弥生1-1-1）
  • 年月日: 2014-11-01 – 2014-11-03
• [学会発表] 一酸化炭素よりも酸素に対して高い親和性を示すミオグロビンの創製 (2014)
  • 著者名/発表者名: R. Nishimura, D. Matsumoto, T. Shibata, S. Yanagisawa, T. Ogura, H. Tai, T. Matsuo, S. Hirota, S. Neya, A. Suzuki, Y. Yamamoto
  • 学会等名: 第52回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: 札幌コンベンションセンター（北海道札幌市白石区東札幌6条1丁目1-1）
  • 年月日: 2014-09-25 – 2014-09-27
• [学会発表] チトクローム酸化酵素の反応初期過程における共役機構の解明 (2014)
  • 著者名/発表者名: S. Nakashima, M. Kubo, I. Ishigami, K. Shinzawa-Itoh, S. Yoshikawa, T. Ogura
  • 学会等名: 第52回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: 札幌コンベンションセンター（北海道札幌市白石区東札幌6条1丁目1-1）
  • 年月日: 2014-09-25 – 2014-09-27
• [学会発表] α鎖あるいはβ鎖の近位ヒスチジンがグリシンに置換された変異ヘモグロビンの機能と構造 (2014)
  • 著者名/発表者名: S. Nagatomo, Y. Nagai, Y. Aki, H. Sakurai, N. Maruyama, K. Imai, N. Mizusawa, T. Ogura, T. Kitagawa, M. Nagai
  • 学会等名: 第52回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: 札幌コンベンションセンター（北海道札幌市白石区東札幌6条1丁目1-1）
  • 年月日: 2014-09-25 – 2014-09-27
• [学会発表] ハーフメトHb Mにおける酸素親和性と正常鎖、異常鎖の配位状態との関係 (2014)
  • 著者名/発表者名: S. Hashihara, M. Okumura, S. Nagatomo, M. Nagai, T. Ogura, T. Kitagawa, M. Hishida, Y. Yamamura, K. Saito
  • 学会等名: 第52回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: 札幌コンベンションセンター（北海道札幌市白石区東札幌6条1丁目1-1）
  • 年月日: 2014-09-25 – 2014-09-27
• [学会発表] 紫外共鳴ラマン分光法による酵素に結合した基質の構造解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 栁澤幸子, 原 雅行, 杉本 宏, 城 宜嗣, 小倉尚志
  • 学会等名: 第52回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: 札幌コンベンションセンター（北海道札幌市白石区東札幌6条1丁目1-1）
  • 年月日: 2014-09-25 – 2014-09-27
• [学会発表] チトクロムc酸化酵素の酸素還元反応の時間分解赤外吸収測定を目的とした酸素肺フローシステムの開発 (2014)
  • 著者名/発表者名: 西口達人, 引田理英, 新澤-伊藤恭子, 吉川信也, 中島 聡, 小倉尚志
  • 学会等名: 第52回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: 札幌コンベンションセンター（北海道札幌市白石区東札幌6条1丁目1-1）
  • 年月日: 2014-09-25 – 2014-09-27
• [学会発表] 紫外共鳴ラマン分光法によるインドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼの三者複合体中間体モデルの研究 (2014)
  • 著者名/発表者名: 萱間紅絵, 栁澤幸子, 杉本 宏, 城 宜嗣, 小倉尚志
  • 学会等名: 第52回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: 札幌コンベンションセンター（北海道札幌市白石区東札幌6条1丁目1-1）
  • 年月日: 2014-09-25 – 2014-09-27
• [学会発表] フルオロ基を含む二核化配位子を有する二核鉄(III)ペルオキソ錯体の合成および酸化反応性の研究 (2014)
  • 著者名/発表者名: 片桐一貴, 古舘英樹, 藤波修平, 鈴木正樹, 秋根茂久, 酒田陽子, 野村高志, 小倉尚志
  • 学会等名: 錯体化学第64回討論会
  • 発表場所: 中央大学後楽園キャンパス（東京都文京区春日1-13-27）
  • 年月日: 2014-09-18 – 2014-09-20
• [学会発表] 酸素活性種を含む二核鉄錯体の合成と酸化反応性 (2014)
  • 著者名/発表者名: 関野実緒, 田崎京佑, 石川敬直, 古舘英樹, 藤波修平, 鈴木正樹, 秋根茂久, 酒田陽子, 野村高志, 小倉尚志
  • 学会等名: 錯体化学第64回討論会
  • 発表場所: 中央大学後楽園キャンパス（東京都文京区春日1-13-27）
  • 年月日: 2014-09-18 – 2014-09-20
• [学会発表] 二核銅(II)ペルオキソ錯体の架橋骨格による酸化反応性の制御 (2014)
  • 著者名/発表者名: 小倉久司, 坂本貴裕, 古舘英樹, 藤波修平, 秋根茂久, 酒田陽子, 鈴木正樹, 野村高志, 小倉尚志
  • 学会等名: 錯体化学第64回討論会
  • 発表場所: 中央大学後楽園キャンパス（東京都文京区春日1-13-27）
  • 年月日: 2014-09-18 – 2014-09-20
• [学会発表] Ni(III)-salen 錯体の一電子酸化体の電子状態 (2014)
  • 著者名/発表者名: 川合 穂, 山口峻英, 正岡重行, 谷 文都, 高妻孝光, Linus Chiang, Tim Storr, 小倉尚志, Robert K. Szilagyi, 島崎優一
  • 学会等名: 錯体化学第64回討論会
  • 発表場所: 中央大学後楽園キャンパス（東京都文京区春日1-13-27）
  • 年月日: 2014-09-18 – 2014-09-20
• [学会発表] Visible and UV resonance Raman study on indoleamine 2,3-dioxygenase (2014)
  • 著者名/発表者名: S. Yanagisawa, M. Hara, K. e. Kayama, H. Sugimoto, Y. Shiro, T. Ogura
  • 学会等名: 8th International Conference on Porphyrins and Phthalocyanines（ICPP-8）
  • 発表場所: Istanbul, Turkey
  • 年月日: 2014-06-22 – 2014-06-27
• [学会発表] Cooperative Structural Dynamics of Proton Pumping Elements in Cytochrome c Oxidase as Studied by Innovative Infrared Spectroscopy (2014)
  • 著者名/発表者名: T. Ogura, S. Nakashima, M. Kubo, S. Yamaguchi, M. Mochizuki, K. Shinzawa-Itoh, S. Yoshikawa
  • 学会等名: 8th International Conference on Porphyrins and Phthalocyanines（ICPP-8）
  • 発表場所: Istanbul, Turkey
  • 年月日: 2014-06-22 – 2014-06-27
  • 招待講演
• [学会発表] 酸素結合型ミオグロビンにおける量子化学的共鳴を通した酸素親和性および自動酸化反応速度の調節 (2014)
  • 著者名/発表者名: 西村 龍, 西山康太郎, 松本大地, 柴田友和, 石上 泉, 小倉尚志, 太 虎林, 長尾 聡, 松尾貴史, 廣田 俊, 荘司長三, 渡辺芳人, 今井清博, 根矢三郎, 鈴木秋弘, 山本泰彦
  • 学会等名: 第41回生体分子科学討論会
  • 発表場所: 九州大学西新プラザ（福岡県福岡市早良区西新2-16-23）
  • 年月日: 2014-06-06 – 2014-06-07
• [学会発表] 時間分解振動分光法でみたチトクローム酸化酵素の反応初期過程での共役機構 (2014)
  • 著者名/発表者名: 中島 聡, 久保 稔, 石上 泉, 新澤-伊藤恭子, 吉川信也, 小倉尚志
  • 学会等名: 第41回生体分子科学討論会
  • 発表場所: 九州大学西新プラザ（福岡県福岡市早良区西新2-16-23）
  • 年月日: 2014-06-06 – 2014-06-07
• [学会発表] インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼの反応機構の解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 萱間紅絵, 栁澤幸子, 杉本 宏, 城 宜嗣, 小倉尚志
  • 学会等名: 第6回日本生物物理学会 中国四国支部大会
  • 発表場所: とりぎん文化会館（鳥取県鳥取市尚徳町101-5）
  • 年月日: 2014-05-17 – 2014-05-18
• [学会発表] チトクローム酸化酵素の反応初期過程での共役機構 (2014)
  • 著者名/発表者名: 中島 聡, 久保 稔, 石上 泉, 新澤-伊藤恭子, 吉川信也, 小倉尚志
  • 学会等名: 第6回日本生物物理学会 中国四国支部大会
  • 発表場所: とりぎん文化会館（鳥取県鳥取市尚徳町101-5）
  • 年月日: 2014-05-17 – 2014-05-18