酵素反応追跡のためのピコリットルインクジェットによる新規高速混合器の試作

2015 年度 実績報告書

• 研究領域: 理論と実験の協奏による柔らかな分子系の機能の科学
• 研究課題/領域番号: 26104532
• 研究機関: 兵庫県立大学
• 研究代表者: 小倉 尚志 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 教授 (70183770)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: 酵素 / 機能メカニズム / 高速混合器 / インクジェットヘッド / 振動分光 / 反応ダイナミクス / 液滴 / タンパク質

研究実績の概要

いかなる生命現象も突き詰めるとタンパク質が駆動する化学反応がもとになっている。したがって、生命とは何か？という問いに答えるためには、タンパク質の機能メカニズムを明らかにする必要がある。この目的のためにはタンパク質の立体構造とダイナミクスの情報が不可欠である。本研究の目的は、タンパク質の構造ダイナミクスを研究するための微量高速混合装置の試作である。構想では、2つのインクジェットヘッドから高速（1～10 m/s）で吐出される微量（100 pL～1 nL）の酵素および基質をそれぞれ含む液滴を衝突させることによって混合し、酵素反応を開始させて時間軸に沿って追跡する。
インクジェットヘッドは、ピエゾ素子に電圧パルス（第1パルス、第2パルス）を印加して液滴を吐出する。これらの電圧パルスの幅はそれぞれ110 μs, 15 μs程度であり、遅延時間は50 μsである。電圧は30 V程度である。これらの最適な値は、液体の粘度と表面張力により異なるため、脱イオン水、緩衝液、界面活性剤入り緩衝液、タンパク質水溶液についてそれぞれ試行錯誤により求めた。
次に液滴の吸収スペクトルを測定するための光学系を組み立て、酸素化型ミオグロビン液滴の吸収スペクトルを測定して試した。その結果、800 pmol以下の試料で測定可能であることがわかった。
さらに、2台のインクジェットヘッドをそれぞれxyzθ軸微動ステージに固定したミキサーを製作した。そして、2つの液滴の衝突・混合を行った。一方、微量試料（80 μl）用吸い上げ式ヘッドについては、電圧パルス印加前に試料溶液が流れ出さないよう保持するために±5 kPa程度の安定した微圧を発生する必要があり、そのための微圧発生装置を組立てた。それを用いて吸い上げ式ヘッドによる液滴の吐出に成功した。
以上により、ピエゾ式インクジェットヘッドの用いた液滴混合装置の試作に成功した。

現在までの達成度 (段落)

27年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

27年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] Formation and High Reactivity of the anti-Dioxo Form of High-Spin μ-Oxodioxodiiron(IV) as the Active Species That Cleaves Strong C-H Bonds (2016)
  • 著者名/発表者名: M. Kodera, S. Ishiga, T. Tsuji, K. Sakurai, Y. Hitomi, Y. Shiota, P. K. Sajith, K. Yoshizawa, K. Mieda, T. Ogura
  • 雑誌名: Chemistry 巻: 22 ページ: 5924-5936
  • DOI: 10.1002/chem.201600048
  • 査読あり
• [雑誌論文] The functional role of the structure of the dioxo-isobacteriochlorin in the catalytic site of cytochrome cd1 for the reduction of nitrite (2016)
  • 著者名/発表者名: H. Fujii, D. Yamaki, T. Ogura, M. Hada
  • 雑誌名: Chem. Sci. 巻: 7 ページ: 2896-2906
  • DOI: 10.1039/c5sc04825g
  • 査読あり
• [雑誌論文] Purification of Active Respiratory Supercomplex from Bovine Heart Mitochondria Enables Functional Studies (2016)
  • 著者名/発表者名: K. Shinzawa-Itoh, H. Shimomura, S. Yanagisawa, S. Shimada, R. Takahashi, M. Oosaki, T. Ogura, T. Tsukihara
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 巻: 291 ページ: 4178-4184
  • DOI: 10.1074/jbc.M115.680553
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A Model for the Active-Site Formation Process in DMSO Reductase Family Molybdenum Enzymes Involving Oxido-Alcoholato and Oxido-Thiolato Molybdenum(VI) Core Structures (2016)
  • 著者名/発表者名: H. Sugimoto, M. Sato, K. Asano, T. Suzuki, K. Mieda, T. Ogura, T. Matsumoto, L. J. Giles, A. Pokhrel, M. L. Kirk, S. Itoh
  • 雑誌名: Inorg. Chem. 巻: 55 ページ: 1542-1550
  • DOI: 10.1021/acs.inorgchem.5b02395
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Effects of Heme Electronic Structure and Distal Polar Interaction on Functional and Vibrational Properties of Myoglobin (2016)
  • 著者名/発表者名: Y. Kanai, R. Nishimura, K. Nishiyama, T. Shibata, S. Yanagisawa, T. Ogura, T. Matsuo, S. Hirota, S. Neya, A. Suzuki, Y. Yamamoto
  • 雑誌名: Inorg. Chem. 巻: 55 ページ: 1613-1622
  • DOI: 10.1021/acs.inorgchem.5b02520
  • 査読あり
• [雑誌論文] A nearly on-axis spectroscopic system for simultaneously measuring UV-visible absorption and X-ray diffraction in the SPring-8 structural genomics beamline (2016)
  • 著者名/発表者名: M. Sakaguchi, T. Kimura, T. Nishida, T. Tosha, H. Sugimoto, Y. Yamaguchi, S. Yanagisawa, G. Ueno, H. Murakami, H. Ago, M. Yamamoto, T. Ogura, Y. Shiro, M. Kubo
  • 雑誌名: J. Synchrotron Rad. 巻: 23 ページ: 334-338
  • DOI: 10.1107/S1600577515018275
  • 査読あり
• [雑誌論文] New mechanistic insight into intramolecular arene hydroxylation initiated by (μ-1,2-peroxo)diiron(III) complexes with dinucleating ligands (2015)
  • 著者名/発表者名: M. Sekino, H. Furutachi, K. Tasaki, T. Ishikawa, S. Mori, S. Fujinami, S. Akine, Y. Sakata, T. Nomura, T. Ogura, T. Kitagawa, M. Suzuki
  • 雑誌名: Dalton Trans 巻: 45 ページ: 469-473
  • DOI: 10.1039/c5dt04088d
  • 査読あり
• [雑誌論文] Generation, Characterization, and Reactivity of a Cu(II)-Alkylperoxide/Anilino Radical Complex: Insight into the O-O Bond Cleavage Mechanism (2015)
  • 著者名/発表者名: S. Paria, T. Ohta, Y. Morimoto, T. Ogura, H. Sugimoto, N. Fujieda, K. Goto, K. Asano, T. Suzuki, S. Itoh
  • 雑誌名: J. Am. Chem. Soc. 巻: 137 ページ: 10870-10873
  • DOI: 10.1021/jacs.5b04104
  • 査読あり
• [雑誌論文] A cryo-generated ferrous-superoxo porphyrin: EPR, resonance Raman and DFT studies (2015)
  • 著者名/発表者名: T. Ohta, J. G. Liu, P. Nagaraju, T. Ogura, Y. Naruta
  • 雑誌名: Chem Commun (Camb) 巻: 51 ページ: 12407-12410
  • DOI: 10.1039/c5cc03520a
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] An Origin of Cooperative Oxygen Binding of Human Adult Hemoglobin: Different Roles of the α and β Subunits in the α2β2 Tetramer (2015)
  • 著者名/発表者名: S. Nagatomo, Y. Nagai, Y. Aki, H. Sakurai, K. Imai, N. Mizusawa, T. Ogura, T. Kitagawa, M. Nagai
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 10 ページ: e0135080
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0135080
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Steric Effect on the Nucleophilic Reactivity of Nickel(III) Peroxo Complexes (2015)
  • 著者名/発表者名: J. Kim, B. Shin, H. Kim, J. Lee, J. Kang, S. Yanagisawa, T. Ogura, H. Masuda, T. Ozawa, J. Cho
  • 雑誌名: Inorg. Chem. 巻: 54 ページ: 6176-6183
  • DOI: 10.1021/acs.inorgchem.5b00294
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Characterization of Mononuclear Non-heme Iron(III)-Superoxo Complex with a Five-Azole Ligand Set (2015)
  • 著者名/発表者名: F. Oddon, Y. Chiba, J. Nakazawa, T. Ohta, T. Ogura, S. Hikichi
  • 雑誌名: Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 巻: 54 ページ: 7336-7339
  • DOI: 10.1002/anie.201502367
  • 査読あり
• [雑誌論文] Stepwise Binding of Two Azide Ions to the O2-reduction Site of Bovine Heart Cytochrome c Oxidase Shown by Resonance Raman Analyses (2015)
  • 著者名/発表者名: M. Hikita, A. Yamamoto, K. Shinzawa-Itoh, T. Ogura, S. Yoshikawa
  • 雑誌名: Chem. Lett. 巻: 44 ページ: 1142-1144
  • DOI: 10.1246/cl.150384
  • 査読あり
• [雑誌論文] Resonance Raman Spectroscopy with Chemical State Selectivity on Histidine and Acetamide Using Synchrotron Radiation (2015)
  • 著者名/発表者名: M. Saito, F. D'Amico, G. Camisasca, F. Bencivenga, R. Cucini, A. Gessini, E. Principi, T. Ogura, C. Masciovecchio
  • 雑誌名: Bull. Chem. Soc. Jpn. 巻: 88 ページ: 591-596
  • DOI: 10.1246/bcsj.20140367
  • 査読あり / 国際共著
• [学会発表] チトクローム酸化酵素の水素結合状態変化の酸素還元反応への影響 (2016)
  • 著者名/発表者名: 青柳裕大, 西口達人, 伊藤-新澤 恭子, 吉川信也, 中島 聡, 小倉尚志
  • 学会等名: 日本化学会第96春季年会
  • 発表場所: 同志社大学京田辺キャンパス（京都府京田辺市多々羅都谷1-3）
  • 年月日: 2016-03-24 – 2016-03-27
• [学会発表] Time-resolved IR spectroscopic studies for proton pumping mechanisms of cytochrome c oxidase (2016)
  • 著者名/発表者名: C. Li, T. Nishiguchi, S. Yamauchi, K. Shinzawa-Itoh, S. Yoshikawa, S. Nakashima, T. Ogura
  • 学会等名: 日本化学会第96春季年会
  • 発表場所: 同志社大学京田辺キャンパス（京都府京田辺市多々羅都谷1-3）
  • 年月日: 2016-03-24 – 2016-03-27
• [学会発表] チトクロムc酸化酵素のP中間体の紫外共鳴ラマン分光 (2016)
  • 著者名/発表者名: 渡邉祥子, 柳澤幸子, 伊藤-新澤 恭子, 吉川信也, 小倉尚志
  • 学会等名: 日本化学会第96春季年会
  • 発表場所: 同志社大学京田辺キャンパス（京都府京田辺市多々羅都谷1-3）
  • 年月日: 2016-03-24 – 2016-03-27
• [学会発表] 時間分解共鳴ラマン分光法によるチトクロムc酸化酵素のCO光解離に伴う構造ダイナミクスの研究 (2016)
  • 著者名/発表者名: 中川善之, 伊藤-新澤 恭子, 吉川信也, 中島 聡, 小倉尚志
  • 学会等名: 日本化学会第96春季年会
  • 発表場所: 同志社大学京田辺キャンパス（京都府京田辺市多々羅都谷1-3）
  • 年月日: 2016-03-24 – 2016-03-27
• [学会発表] ピコメートルレベルの構造解析に基づく呼吸の分子メカニズム (2016)
  • 著者名/発表者名: 小倉尚志
  • 学会等名: 茨城大学大学院理工学研究科 ミニシンポジウム ～量子生命科学を切り拓く～
  • 発表場所: 茨城大学水戸キャンパス ライブラリーホール（茨城県水戸市文京2丁目1-1）
  • 年月日: 2016-02-22 – 2016-02-22
  • 招待講演
• [学会発表] Molecular Mechanisms of Cytochrome c Oxidase as Studied by Vibrational Spectroscopy (2015)
  • 著者名/発表者名: T. Ogura, N. Satoru, K. Shinzawa-Itoh, S. Yoshikawa
  • 学会等名: 5th Asian Spectroscopy Conference on Vibrational Spectroscopy University of Sydney, Australia
  • 発表場所: University of Sydney, Australia
  • 年月日: 2015-09-29 – 2015-10-02
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] ルテニウム-NHC 錯体を触媒とする水中での基質酸化反応 (2015)
  • 著者名/発表者名: 下山祥弘, 石塚智也, 小谷弘明, 三枝 馨, 小倉尚志, 塩田淑仁, 吉澤一成, 小島隆彦
  • 学会等名: 錯体化学会第65回討論会
  • 発表場所: 奈良女子大学（奈良県奈良市北魚屋西町）
  • 年月日: 2015-09-21 – 2015-09-23
• [学会発表] 二核化配位子の架橋骨格による二核銅(II)ペルオキソ錯体の酸化反応性の制御 (2015)
  • 著者名/発表者名: 小倉久司, 古舘英樹, 藤波修平, 秋根茂久, 酒田陽子, 野村高志, 小倉尚志, 鈴木正樹
  • 学会等名: 錯体化学会第65回討論会
  • 発表場所: 奈良女子大学（奈良県奈良市北魚屋西町）
  • 年月日: 2015-09-21 – 2015-09-23
• [学会発表] 酸素活性種を含む二核鉄錯体の酸化反応性 (2015)
  • 著者名/発表者名: 関野実緒, 古舘英樹, 藤波修平, 秋根茂久, 酒田陽子, 野村高志, 小倉尚志, 鈴木正樹
  • 学会等名: 錯体化学会第65回討論会
  • 発表場所: 奈良女子大学（奈良県奈良市北魚屋西町）
  • 年月日: 2015-09-21 – 2015-09-23
• [学会発表] キノリル基を有する二核化配位子を用いた二核鉄(III)ペルオキソ錯体の合成 (2015)
  • 著者名/発表者名: 東條莉奈, 石黒智子, 古舘英樹, 藤波修平, 秋根茂久, 酒田陽子, 野村高志, 小倉尚志, 鈴木正樹
  • 学会等名: 錯体化学会第65回討論会
  • 発表場所: 奈良女子大学（奈良県奈良市北魚屋西町）
  • 年月日: 2015-09-21 – 2015-09-23
• [学会発表] チトクロームc酸化酵素における酸素還元反応とプロトンポンプ共役機構 (2015)
  • 著者名/発表者名: 中島 聡, 西口達人, 李 辰, 伊藤-新澤 恭子, 吉川信也, 小倉尚志
  • 学会等名: 第53回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: 金沢大学 角間キャンパス 自然科学本館（石川県金沢市角間町）
  • 年月日: 2015-09-13 – 2015-09-15
• [学会発表] Active supercomplex purified from bovine heart reveals the functional unit of the mitochondrial respiratory chain (2015)
  • 著者名/発表者名: 伊藤-新澤 恭子, 下村陽信, 柳澤幸子, 島田 悟, 高橋涼子, 上根滋史, 小倉尚志, 吉川信也, 月原冨武
  • 学会等名: 第53回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: 金沢大学 角間キャンパス 自然科学本館（石川県金沢市角間町）
  • 年月日: 2015-09-13 – 2015-09-15
• [学会発表] 共鳴ラマン分光法による2価コバラミンのpHに依存した構造変化の検出 (2015)
  • 著者名/発表者名: 三枝 馨, 小倉尚志
  • 学会等名: 第53回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: 金沢大学 角間キャンパス 自然科学本館（石川県金沢市角間町）
  • 年月日: 2015-09-13 – 2015-09-15
• [学会発表] ハーフメトヘモグロビンMを用いたヒト成人ヘモグロビンの酸素親和性制御に関するα鎖とβ鎖のFe-His結合の役割の違いに関する研究 (2015)
  • 著者名/発表者名: 長友重紀, 齋藤一弥, 長井雅子, 小倉尚志, 北川禎三
  • 学会等名: 第53回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: 金沢大学 角間キャンパス 自然科学本館（石川県金沢市角間町）
  • 年月日: 2015-09-13 – 2015-09-15
• [学会発表] Development of On-axis Simultaneous Measurement System of UV-Visible Absorption and X-ray Diffraction at SPring-8 (2015)
  • 著者名/発表者名: M. Sakaguchi, T. Kimura, T. Nishida, T. Tosha, S. Yanagisawa, G. Ueno, H. Murakami, H. Ago, M. Yamamoto, T. Ogura, Y. Shiro, M. Kubo
  • 学会等名: Synchrotron Radiation Instrumentation (SRI2015)
  • 発表場所: NY Marriot Marquis (USA)
  • 年月日: 2015-07-06 – 2015-07-10
  • 国際学会
• [学会発表] ケージドNOを用いた脱窒カビ由来NO還元酵素結晶における反応中間体の調製 (2015)
  • 著者名/発表者名: 西田拓真, 當舎武彦, 坂口美幸, 木村哲就, 柳澤幸子, 上野 剛, 村上博則, 山本雅貴, 小倉尚志, 城 宜嗣, 久保 稔
  • 学会等名: 第15回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: あわぎんホール（徳島県徳島市藍場町2-14）
  • 年月日: 2015-06-24 – 2015-06-26
• [学会発表] 機能を保持したウシ心筋ミトコンドリア呼吸鎖超複合体の調製 (2015)
  • 著者名/発表者名: 伊藤-新澤恭子, 下村陽信, 柳澤幸子, 島田 悟, 小倉尚志, 月原冨武
  • 学会等名: 第15回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: あわぎんホール（徳島県徳島市藍場町2-14）
  • 年月日: 2015-06-24 – 2015-06-26
• [学会発表] Newly Developed systems of time-resolved IR spectroscopy for elucidating the proton pumping reaction of cytochrome c oxidase (2015)
  • 著者名/発表者名: C. Li, T. Nishiguchi, K. Shinzawa-Itoh, S. Yoshikawa, S. Nakashima, T. Ogura
  • 学会等名: 第15回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: あわぎんホール（徳島県徳島市藍場町2-14）
  • 年月日: 2015-06-24 – 2015-06-26
• [学会発表] 共鳴ラマンスペクトルから見た異種生物由来ヘムオキシゲナーゼ-ヘム複合体の独自性 (2015)
  • 著者名/発表者名: 右田たい子, 三宅倫生, 柳澤幸子, 小倉尚志
  • 学会等名: 第42回生体分子科学討論会
  • 発表場所: 高崎シティーギャラリーコアホール（群馬県高崎市高松町35-1）
  • 年月日: 2015-06-12 – 2015-06-13
• [学会発表] 紫外共鳴ラマン分光法によるインドールアミン2,3ジオキシゲナーゼ反応中間体モデルの基質の検出 (2015)
  • 著者名/発表者名: 柳澤幸子, 萱間紅絵, 杉本 宏, 城 宜嗣, 小倉尚志
  • 学会等名: 第42回生体分子科学討論会
  • 発表場所: 高崎シティーギャラリーコアホール（群馬県高崎市高松町35-1）
  • 年月日: 2015-06-12 – 2015-06-13
• [学会発表] チトクロームc酸化酵素の酸素還元反応とプロトンポンプの共役機構 (2015)
  • 著者名/発表者名: 中島 聡, 西口達人, Chen Li, 中川善之, 青柳裕大, 新澤-伊藤恭子, 吉川信也, 小倉尚志
  • 学会等名: 第42回生体分子科学討論会
  • 発表場所: 高崎シティーギャラリーコアホール（群馬県高崎市高松町35-1）
  • 年月日: 2015-06-12 – 2015-06-13
• [学会発表] Effects of Proton Motive Force on the Structure and Dynamics of Cytochrome c Oxidase: Resonance Raman Spectroscopy (2015)
  • 著者名/発表者名: T. Ogura, T. Nomura, S. Yanagisawa, K. Shinzawa-Itoh, S. Yoshikawa
  • 学会等名: 5th Georgian Bay International Conference on Bioinorganic Chemistry (CanBIC5)
  • 発表場所: Parry Sound, Canada
  • 年月日: 2015-05-19 – 2015-05-23
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Detection of tryptophan as bound substrate in the indoleamine 2,3-dioxygenase intermediate model (2015)
  • 著者名/発表者名: S. Yanagisawa, K. Kayama, H. Sugimoto, Y. Shiro, T. Ogura
  • 学会等名: 5th Georgian Bay International Conference on Bioinorganic Chemistry (CanBIC5)
  • 発表場所: Parry Sound, Canada
  • 年月日: 2015-05-19 – 2015-05-23
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] プロトンポンプ機能に必要な部品の働き (2015)
  • 著者名/発表者名: 小倉尚志
  • 学会等名: 分子研研究会「膜タンパク質内部のプロトン透過を考える」
  • 発表場所: 分子科学研究所 岡崎コンファレンスセンター（愛知県岡崎市明大寺町字西郷中38）
  • 年月日: 2015-04-20 – 2015-04-21
  • 招待講演