公募研究
hIAPPとオートファジーの関連に関して検討する目的で、まず、膵β細胞株INS-1細胞にhIAPPとラットIAPPをそれぞれアデノウイルスを用いて強制発現して、オートファジーフラックスを評価した。その結果、ラットIAPP発現時に比して、hIAPPの強制発現時にオートファジーフラックスの亢進を認めた。次にIAPP強制発現時のオートファジー亢進の意義を検討する目的で、INS-1細胞においてオートファジー過程に不可欠なタンパクであるAtg7の発現をsiRNAを用いて抑制した。その結果、hIAPPの強制発現にINS-1細胞のアポトーシスの亢進が認められるが、その状態でAtg7の発現を抑制するとさらなるアポトーシスの亢進が認められた。これらのことよりhIAPPは生理的発現量でわずかに膵β細胞毒性を有するが、その毒性はオートファジー活性を亢進させることにより抑制されている。この状態でオートファジー不全が併存すると膵β細胞毒性が亢進する可能性が示唆された。そこで、次にin vivoでのhIAPPとオートファジー不全との関連を検討する目的で、hIAPPノックインマウスと膵β細胞特異的Atg7ノックアウトマウスを掛け合わせ、その関連性を検討した。その結果、高脂肪食負荷時のマウスの耐糖能に関しては、膵β細胞特異的オートファジー不全マウスに比して、そのマウスとhIAPPノックインマウスを掛け合わせたマウスにおいて耐糖能の悪化が認められた。さらに膵β細胞容積の検討においても両者を掛け合わせることで、協調的に膵β細胞容積が低下することが明らかとなった。これらの結果から、hIAPPはインスリン抵抗性下の膵β細胞に対する毒性を有するが、通常はオートファジーにより、この毒性が中和されている。ここにオートファジー不全が加わると膵β細胞傷害が惹起されることが示唆された。また、このさい、hIAPPノックイン＆Atg7ノックアウトマウスにおいては、p62陽性封入体の欠如が認められた。
2: おおむね順調に進展している
今回、研究計画に挙げた、１）hIAPP発現時のp62陽性封入体形成不全の検討と２）膵β細胞におけるp62蛋白蓄積の病態生理学的意義に関して、１）に関しては上述の通り、一定のデータを出すことができ、本年度論文化もできた。また、それに加え、膵β細胞ノックアウトマウスで発現が増加する蛋白ERp57の解析も行い論文化もできた。今後、そのメカニズムの検討を予定している。２）に関しても、現在、解析に必要なマウスの数がそろいつつあり、来年度中に何らかの結果が出せると思われる。
１）hIAPP発現時のp62陽性封入体形成不全の検討本計画に関して、今後、誘導性Atg7ノックアウト株にhIAPPを強制発現させ、p62陽性封入体の挙動を観察することにより、どのような状況でp62陽性封入体ができるのか、それを阻止するシグナルはどのようなものかに関して解析を加える。２）膵β細胞におけるp62蛋白蓄積の病態生理学的意義本研究に関して、既に、全身のp62ノックアウトマウスではインスリン抵抗性が惹起されることが知られているため、本実験に適さない。そこで、膵β細胞特異的p62ノックアウトマウスを作製することとした。 まず、p62欠損のみの影響を検討するために膵β細胞特異的p62ノックアウトマウスを作成した。このマウスにおいて体重、血糖、腹腔内ブドウ糖負荷試験におけるブドウ糖およびインスリン応答、膵島容積を測定したがいずれも著変を認めなかった。すなわち、このマウスが今後の実験に供することができることが確認された。そこで、現在、膵特異的p62,Atg7ダブルノックアウトマウスを作成している。本年度中にこのphenotypeが明らかになると思われる。。
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