| 研究領域 | 生殖細胞のエピゲノムダイナミクスとその制御 |
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| 研究課題/領域番号 |
26112507
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
青木 不学 東京大学, 新領域創成科学研究科, 教授 (20175160)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | リプログラミング / 初期胚 / 卵 / Fbxw |
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| 研究実績の概要 |
本研究においては、ゲノムリプログラミングを調節するメカニズムとして、クロマチン構造に関わるヒストン修飾や変異体のクロマチンへの取り込みを調節する因子が受精後に急速に消失することがその１つの要因であり、そのような因子をコードする母性mRNAは受精後に急速に分解されていると考えた。そこで、受精後に急速に分解される母性mRNAに着目することでリプログラムに関わる因子を探索し、その作用機序を解析することでゲノムリプログラミングのメカニズムを明らかにすることを計画した。
そこでまず、mRNAが受精直後に急激に分解される遺伝子の探索を試みた。これまでに得られているMII期卵および１細胞期胚のRNAseqデータに加え、新たに成長卵（卵核胞期卵）のRNAseqを行い、これらのデータを合わせて減数分裂再開時には大きな変化がないにもかかわらず、受精後に急激にmRNAの発現量が減少する遺伝子を探索した。その結果、数百の候補遺伝子が得られたが、さらにこの中で他の組織にはなく卵特異的に発現している遺伝子という条件を加えることで候補遺伝子を50に絞り込むことができた。そしてその中に、Fbxw13, Fbxw18というFbxwファミリーに属する遺伝子が2つ存在したことから、Fbxwファミリーに属する遺伝子に着目することにした。Fbxwファミリーには、大別して第9番染色体上にクラスターを形成する15の遺伝子と、それ以外の染色体に散在する遺伝子が属している。上述したFbxw13, Fbxw18はいずれもクラスターを形成するグループに属しているため、その他のクラスター内の遺伝子についてその発現を調べたところ、そのすべてが受精後に急速に分解されており、さらに一部に精巣での発現が見られるものの、その大部分が卵巣特異的な発現をしていることがRT-PCRにより確認できた。今後は、これらの遺伝子の機能を解析する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度の計画は、研究実績の項で記したように、リプログラミングに関わる因子を明らかにするために、母性mRNAの中で受精を機として急激に分解されるmRNAを網羅的に探索するというものである。そこで、それまでに得られている未受精卵および1細胞期胚のRNAシーケンスのデータに加え、新たに成長卵のRNAシーケンスを行い、mRNAが受精後に急激に分解される遺伝子の探索を行った。その結果、344個の遺伝子が得られ、これらの各組織での発現を調べたところ、50個が卵特異的な発現を示していた。すなわち、分解パターンによるスクリーニングで得られた候補遺伝子のうち約1/7という高い割合で卵特異的であったということは、受精後に急激に分解されるものはこの時期に何らかの特別の機能を有している可能性が高いということを示しているものと言える。
また、得られた候補遺伝子の中にFbxwファミリーに属する遺伝子があり、それらが含まれているクラスター内にある他の13個の遺伝子も同様に卵特異的かつ受精後の急激な分解が見られたことも大変興味深い結果である。このように1つの遺伝子が重複して多数の遺伝子が生じ、さらに同様の卵特異的な発現パターンを維持していることを鑑みると、これらは卵特異的に重要な機能を有していることが予測される。
以上、本研究プロジェクトは、ここまでの結果で十分な進展があったものと考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
(1)RNAiを用いる発現抑制、およびcRNA1を用いる過剰発現による機能解析
①成長卵に、Fbxwの発現を抑制するRNAiを顕微授精して体外成長させることにより、その後の減数分裂および受精後の発生への影響を調べる。Fbxwファミリーのクラスター遺伝子群は互いに非常に類似したアミノ酸配列を持っていることから、互いにredundantな機能を有していることが予測される。したがって、これらを共通にノックダウンできるRNAiにより発現抑制を行う。尚、2種のRNAiを同時に顕微注入することですべてのクラスター内の遺伝子をノックダウンできることは確認できている。②Fbxwファミリーの遺伝子のcRNAを合成し、未受精卵に顕微注入を行うことで受精後の継続した発現を促し、その後の発生および遺伝子発現への影響を調べる。mRNAの分解は主にその3’非コード領域によって調節されていることから、コード領域に直接poly-A鎖を付加したcRNAを多量に顕微注入することにより、受精後の急激な分解を免れタンパク質の合成が維持されることが期待される。
(2)受精後の分解抑制による機能解析
①Fbxwファミリーか間で共通する3’非コード領域の配列を探索する。次いで、この配列をリポーター遺伝子の3’末端に繋いだプラスミドを構築し、そこから合成したcRNAを成長卵および未受精卵に顕微注入してその分解を調べることで、実際にその配列が急速な分解に関わっているかどうかを明らかにする。②上記①で機能が認められた3’非コード領域の配列に相補するcDNAを成長卵あるいは未受精卵に顕微注入して、母性mRNAの分解への影響を調べると共に、その後の発生および遺伝子発現を調べる。
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