2014 年度実績報告書

GS細胞を用いた雄性エピゲノム形成の分子基盤の解明と新規解析技術の開発

公募研究

研究領域	生殖細胞のエピゲノムダイナミクスとその制御
研究課題/領域番号	26112513
研究機関	慶應義塾大学
研究代表者	山中総一郎慶應義塾大学, 医学部, 助教 (80711845)
研究期間 (年度)	2014-04-01 – 2016-03-31
キーワード	エピゲノム / gonad / ヘテロクロマチン / トランスポゾン / piRNA / PIWI / ChIP / 遺伝子発現
研究実績の概要	本年度は、特定ゲノム領域に存在するタンパク質やRNAを同定するための手法の開発を主眼に置いて研究を進めた。申請書に記載したように、PIWI/piRNAによって発現抑制を受けるプラスミドを細胞から回収することを当初計画していた。その計画通りPIWI/piRNAによって発現抑制を受けるレポータープラスミドを構築することが出来た。しかし、構築したレポータープラスミドを細胞から回収するステップがうまく働かず、それに換わる系の開発に着手した。この別の系においてはCRISPR/Cas9システムをベースにして、特定のゲノム領域を濃縮することを目指している。具体的には、ゲノム切断活性を持つアミノ酸に変異を導入したCas9と、興味のある遺伝子座で設計したgRNAを細胞に導入する。その後細胞を固定し、Cas9を細胞から免疫沈降した。当該年度では、転写が活発に行われている遺伝子座を標的にこの手法を適用した。その結果、免疫沈降産物の中にヌクレオソームが銀染色で確認出来る程度にまで系を改良することに成功した。さらに転写やスプライシングに関与する核内タンパク質群の濃縮も見られた。次にこの手法をトランスポゾン領域で行った。申請者の使用したOSCはハエの卵巣から樹立された培養細胞で、トランスポゾンの転写はヘテロクロマチン形成を介して抑制されている。ヘテロクロマチン領域は一般的には高次構造をとり、タンパク質が近づきにくいゲノム領域だと考えられている。この領域にgRNAを設計し、Cas9によってゲノムが切断されたかを確認したところ、興味深いことにCas9はトランスポゾン周辺に形成されるヘテロクロマチン化されたゲノムを切断できることが明らかとなった。現在、トランスポゾン領域に存在するタンパク質群を上記のCRISPR/Cas9システムで免疫沈降し、それらを網羅的に同定している。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由「研究実績の概要」でも述べたように、当初のプラスミドをもとにした系の構築は、現在までに達成できていない。そこで当該年度では、CRISPR/Cas9をベースにしたシステムをそれに換わる系として構築してきた。プラスミドをベースにした系の長所は、レポータープラスミドに導入するトランスポゾン配列を容易に改変できるところにある。具体的には、「全長のトランスポゾンとプロモーター活性を失ったトランスポゾンではゲノム上に存在するタンパク質群にどのような違いがあるか」といったことを簡便に検証できる。ただ、あくまでプラスミドは外部から導入したものであり、それらが生体内で起こっていることと同じ挙動を示す保証はない。それに対してCRISPR/Cas9を用いた系では、注目した遺伝子座の精細な改変を行うには時間や手間がかかる一方で、細胞内にもともと存在する染色体を検証する点にある。さらに、ゲノム上にはプロモーター活性を失ったトランスポゾンも存在することから、上に挙げたような内容の実験も実証可能である。以上の理由から、当初予定していた系よりも様々な点ですぐれた系が構築されつつあると考えられる。
今後の研究の推進方策	１．特定ゲノム領域を濃縮する系に関して CRISPR/Cas9を用いた特定ゲノム領域の濃縮において、免疫沈降産物には多くのバックグラウンドが存在する。申請者はgRNAの有無という点に着目し、gRNAの存在下で特異的に免疫沈降される因子群をピックアップした。ただ、この実験系においてgRNAを導入していない細胞から免疫沈降してきた画分にも相当数のタンパク質が存在することを確認している。これらは、免疫沈降に用いたビーズや抗体、Cas9タンパク質に「非特異的に」結合しているものである。申請者の注目するタンパク質群はCas9タンパク質が結合するゲノム領域に存在するものである。言い換えると、それらの因子群の濃縮はDNaseに感受性となるはずである。そこで、精製の最終ステップである「ビーズからの免疫沈降産物の溶出」を現行の界面活性剤ではなくDNaseを用いて行う。この処理により、ビーズや抗体、Cas9タンパク質に非特異的に結合する因子群が溶出されないと期待され、免疫沈降産物内のバックグラウンドの大幅な低減につながると考える。２．MIWI2とポリコーム複合体の機能的関連について申請者はこれまでにMIWI2とポリコーム複合体が相互作用することをツーハイブリッド法で確認している。当該年度ではこの相互作用を個体サンプルを用いて検証する。その際に、MIWI2が特異的に発現しているゴノサイトをFACS法で濃縮する必要がある。よって本年度は、ゴノサイトの濃縮に利用できる特殊なマウスの飼育を始め、さらに十分に濃縮されたゴノサイトを大量に回収することも平行して目指す。