公募研究
非コード領域は、脆弱部位、組換えホットスポット、へテロクロマチン、テロメア、セントロメア等、通常の配列と違う特性を持つ領域で、これらはDNA複製の進行に干渉する。染色体が安定に維持されるには、この領域で複製フォークの機能適応が重要である。本課題ではヒト細胞の非コード配列からDNA合成干渉配列を抽出し、この配列でのヒト複製関連因子の挙動を解析し、複製フォークの機能的適応機構の解明を目的としている。これまでに、脆弱配列、セントロメア、ウイルス由来の末端反復配列を単離し、出芽酵母YCpベクター、SV40ウイルス複製開始点を持つpcDNAベクターに挿入した。前者では出芽酵母野生株でのプラスミド安定性の測定を行った。いくつかの配列で、安定性への影響を示唆する結果が出たが、十分に有意と言えなかった。これに対して後者DNAについては、SV40T抗原発現のヒト培養細胞に一過的に導入し、複製能を制限酵素DpnIに対する感受性から測定した。その結果、さまざまな非コード配列で、この系の複製における干渉が見られた。このような複製干渉が見られたヘルペスウイルスの１種の末端反復配列については、このウイルス由来の核抗原は、この末端反復配列に結合するとともに宿主複製因子RFCに強く結合することが報告されている。我々の解析で、核抗原とRFCの結合によって、複製クランプPCNAが効率よく末端反復配列DNAにロードされることを明らかにした。したがって、非コード領域の複製と複製因子の特異的リクルートの間につながりがあることが示唆された。
2: おおむね順調に進展している
用意した代表的非コード配列について、ヒト細胞でのSV40ウイルス複製開始点依存的な複製を使って、複製干渉を解析することが可能になった。この解析系を使い、ウイルス末端反復配列に複製干渉があることを見いだした。またそのウイルスの核抗原と宿主複製因子RFCの特異的結合を基にして、この反復配列に両者の結合を介した効率よいPCNAのローディングがあることを示した。これは非コード配列の複製干渉に対して複製因子の特異的リクルートが起きることを示唆した重要な知見と考える。
1. 非コードDNA配列について、ヒト細胞、酵母細胞を使って複製進行の安定性の程度を定量的に進める。これに伴い、複製に関係した変異、薬剤の複製干渉への影響を解析する。2. 複製干渉の見られた非コードDNA配列について、各ローダー、クランプの結合活性、結合特異性の解析を行い、複製干渉配列への複製因子のリクルートについて関連性を明らかにする。3. 精製したヒトDNA ポリメラーゼを使い、これら非コードDNA配列上のDNA合成モードを解析する。さらに各クランプ、ローダーを含む各種複製因子存在下でのDNA合成モードの変化を解析する。これらの解析結果を基にして、特異的複製因子のリクルートによる非コードDNAの複製モードの切り替えについての知見を集め、それが非コードDNA安定性維持に重要であることを示す。
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すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件) 学会発表 (7件) (うち招待講演 2件)
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