細菌の走性における数的多様性の解明

2014 年度 実績報告書

• 研究領域: 少数性生物学―個と多数の狭間が織りなす生命現象の探求―
• 研究課題/領域番号: 26115706
• 研究機関: 名古屋工業大学
• 研究代表者: 井上 圭一 名古屋工業大学, 工学(系)研究科(研究院), 助教 (90467001)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: ロドプシン / Cheタンパク質 / 一分子測定 / 全反射蛍光顕微鏡

研究実績の概要

本研究では細菌の走光性に関わる光受容体である、センサリーロドプシン（SR）－トランスデューサータンパク質(Htr)複合体と、Cheタンパク質の間の信号伝達過程を一分子観察し、光信号の増幅過程を定量的に明らかにすることを目的とする。そして今年度は主に観察のための顕微システムの構築を行った。今研究では二種類のセンサリーロドプシン、すなわち正の走光性に関わるセンサリーロドプシンＩ（SRI）と負の走光性に関わるセンサリーロドプシンⅡ（SRII）の間の比較を行い、これら２つの走光性のセンサータンパク質の間でどの様に信号伝達過程が異なるのか、その多様性を調べることを目的の一つとするが、それぞれの分子は吸収する光の波長が大きく異なるため、光励起と蛍光検出の波長を大きく切り替える必要がある。そこで新たに561 nmと647 nmの二つの半導体レーザーの励起光を導入することが可能な、波長切替式の投光管をメーカーと共にデザインし、観察用の顕微鏡に導入した。そうしたところ両方の励起波長において明瞭な一分子像を得ることに成功した。
またこれまで我々はDylight色素を用いたSRIの検出のみを行ってきたため、今年度はSRIIの観察に向けて新しい色素の選別と、それによるタンパク質の標識について標識方法の検討を行った。その結果FRETのドナーとしてCy3を、アクセプターとしてCy5色素を用いる系を使うことで十分にSRIIを標識できることが示された。さらにSRIIと複合体を形成するトランスデューサータンパク質（HtrII）についても新たに大腸菌による発現系を構築し、大腸菌からの精製法について検討を行ったが、研究に十分な純度でタンパク質を得ることは難しかった。従って今後はSRIIとのフュージョンタンパク質として得ることにより、より高い純度で十分な試料を得ることができるかどうか検討を試みる。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

今年度は当初計画を行っていた複数の励起波長に対応した顕微鏡を構築することに成功し、十分な信号－ノイズ比で一分子の蛍光像を観察することに成功した。また新たに研究を開始したSRII-HtrIIの系についてはSRI-HtrIの系は異なる波長の蛍光色素で観察することが必要になるが、これについてもCy3-Cy5の蛍光色素の組み合わせを用いることで、十分に一分子観察が可能である事が示された。
一方HtrIIの発現に関しては、タンパク質を大腸菌により発現させることを試みたが、発現量がそれほど十分でなく、一分子観察に必要とされる純度で精製を行うことが難しいことが明らかになった。これについては今後SRIIとのフュージョンタンパク質として精製することを改めて検討する。

今後の研究の推進方策

今後は今年度構築を行った蛍光一分子顕微鏡を用いて、実際にSR-Htr複合体からCheタンパク質へ信号伝達が行われる過程について観察を行い、どのようにして信号増幅が達成されているのか、その詳細について増幅率の定量的な評価も含めて研究を行う。また正の走光性に関与するSRI-HtrIと負の走光性に関与するSRII-HtrIIの間で、信号増幅過程にどの様な違いがあるのか、また種が異なった場合それぞれの複合体からCheタンパク質への信号伝達過程にはどの様な差が見られるのかといった多様性についても明らかにすることを目指す。また観察法について当領域の他のグループとの共同研究を通じてより適切な手法の検討を行ったり、我々の持つ光受容タンパク質について他グループの測定手法や解析手法により動作メカニズムについてのさらなる研究を行うことも検討していく。

研究成果

• [雑誌論文] Light-driven ion-translocating rhodopsins in marine bacteria (2015)
  • 著者名/発表者名: K. Inoue , Y. Kato, H. Kandori*
  • 雑誌名: Trends Microbiol. 巻: 23 ページ: 91-98
  • DOI: 10.1016/j.tim.2014.10.009
• [雑誌論文] Structural Basis for Na+ Transport Mechanism by a Light-Driven Na+ Pump (2015)
  • 著者名/発表者名: H. E. Kato, K. Inoue, R. Abe-Yoshizumi, Y. Kato, H. Ono, M. Konno, T. Ishizuka, M. R. Hoque, S. Hososhima, H. Kunitomo, J. Ito, S. Yoshizawa, K. Yamashita, M. Takemoto, T. Nishizawa, R. Taniguchi, K. Kogure, A. D. Maturana, Y. Iino, H. Yawo, R. Ishitani, H. Kandori, O. Nureki
  • 雑誌名: Nature 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: in press
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Converting a Light-driven Proton Pump into a Light-gated Proton Channel (2015)
  • 著者名/発表者名: Keiichi Inoue, Takashi Tsukamoto, Kazumi Shimono, Yuto Suzuki, Seiji Miyauchi, Shigehiko Hayashi, Hideki Kandori, Yuki Sudo
  • 雑誌名: Journal of the American Chemical Society 巻: 137 ページ: 3291-3299
  • DOI: 10.1021/ja511788f
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Na+ Transport by Sodium Ion Pump Rhodopsin is Resistant to Environmental Change -A Comparison of Photocycles of Na+ and Li+ Transport Processes (2014)
  • 著者名/発表者名: Keiichi Inoue, Hikaru Ono, Hideki Kandori
  • 雑誌名: Chemistry Letters 巻: 44 ページ: 294-296
  • DOI: 10.1246/cl.141023
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Spectroscopic Study of a Light-Driven Chloride Ion Pump from Marine Bacteria (2014)
  • 著者名/発表者名: Keiichi Inoue, Faisal Hammad Mekky Koua, Yoshitaka Kato, Rei Abe-Yoshizumi, Hideki Kandori
  • 雑誌名: The Journal of Physical Chemistry B 巻: 118 ページ: 11190-11199
  • DOI: 10.1021/jp507219q
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] FTIR Spectroscopy of a Light-Driven Compatible Sodium Ion-Proton Pumping Rhodopsin at 77 K (2014)
  • 著者名/発表者名: Hikaru Ono, Keiichi Inoue, Rei Abe-Yoshizumi, Hideki Kandori
  • 雑誌名: The Journal of Physical Chemistry B 巻: 118 ページ: 4784-4792
  • DOI: 10.1021/jp500756f
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Molecular and evolutionary aspects of microbial sensory rhodopsins (2014)
  • 著者名/発表者名: Keiichi Inoue, Takashi Tsukamoto, Yuki Sudo
  • 雑誌名: Biochimica et Biophysica Acta 巻: 87 ページ: 2587-2597
  • DOI: 10.1016/j.bbabio.2013.05.005
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] 微生物型ロドプシンの信号伝達の解明に向けた1分子観察法の開発 (2014)
  • 著者名/発表者名: 井上圭一
  • 雑誌名: 日本生化学会誌 生化学・近畿支部特集「生化学に新たな視点を与える技術の開発とその応用」 巻: 86 ページ: 160-166
• [雑誌論文] 光駆動ナトリウムポンプの発見 (2014)
  • 著者名/発表者名: 井上圭一, 神取秀樹
  • 雑誌名: 生物物理 巻: 54 ページ: 106-107
• [学会発表] Spectroscopic study on the dynamics and structure of sodium pump rhodopsin (2015)
  • 著者名/発表者名: Keiichi Inoue
  • 学会等名: 日本化学会第94春季年会(2014)
  • 発表場所: Funabashi, Japan
  • 年月日: 2015-03-27 – 2015-03-27
  • 招待講演
• [学会発表] 細菌の走性における数的多様性の解明 (2015)
  • 著者名/発表者名: 井上圭一
  • 学会等名: 新学術領域研究「少数性生物学」第8回領域会議
  • 発表場所: 北海道
  • 年月日: 2015-01-31 – 2015-01-31
• [学会発表] 光駆動ナトリウムポンプ型ロドプシンの発見と輸送メカニズム (2014)
  • 著者名/発表者名: 井上圭一
  • 学会等名: 機能物性融合科学研究会シリーズ(1)「光機能」
  • 発表場所: 柏
  • 年月日: 2014-12-04 – 2014-12-04
  • 招待講演
• [学会発表] Microbial rhodopsins of marine bacteria: Nano-scale biological light-driven ion pumps (2014)
  • 著者名/発表者名: Keiichi Inoue
  • 学会等名: 25th 2014 International Symposium on Micro-NanoMechatronics and Human Science
  • 発表場所: Nagoya, Japan
  • 年月日: 2014-11-12 – 2014-11-12
  • 招待講演
• [学会発表] Function and mechanism of sodium pump rhodopsin (2014)
  • 著者名/発表者名: Keiichi Inoue
  • 学会等名: 16th International Conference on Retinal Proteins
  • 発表場所: Nagahama, Japan
  • 年月日: 2014-10-07 – 2014-10-07
  • 招待講演
• [学会発表] Spectroscopic Study of a Light-Driven Chloride Ion Pump from Marine Bacteria (2014)
  • 著者名/発表者名: Keiichi Inoue, Faisal Hammad Mekky Koua, Yoshitaka Kato, Rei Abe-Yoshizumi, Hideki Kandori
  • 学会等名: 16th International Conference on Retinal Proteins
  • 発表場所: Nagahama, Japan
  • 年月日: 2014-10-06 – 2014-10-09
• [学会発表] The Extracellular pH Dependency of Transport Activity by Light-driven Sodium Ion Pump (2014)
  • 著者名/発表者名: Rei Abe-Yoshizumi, Yoshitaka Kato, Keiichi Inoue, Hideki Kandori
  • 学会等名: The 52nd Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
  • 発表場所: Sapporo, Japan
  • 年月日: 2014-09-27 – 2014-09-27
• [学会発表] Role of D116 for the Na+ Pump Activity and Molecular Property of NdR2 (2014)
  • 著者名/発表者名: Shinya Sugita, Keiichi Inoue, Rei Abe-Yoshizumi, Yoshitaka Kato, Hideki Kandori
  • 学会等名: The 52nd Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
  • 発表場所: Sapporo, Japan
  • 年月日: 2014-09-27 – 2014-09-27
• [学会発表] Functional Restoration of a Pseudo Gene of Rhodopsin with NDQ Motif (2014)
  • 著者名/発表者名: Yuto Suzuki, Keiichi Inoue, Rei Abe-Yoshizumi, Hideki Kandori
  • 学会等名: The 52nd Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
  • 発表場所: Sapporo, Japan
  • 年月日: 2014-09-25 – 2014-09-25
• [学会発表] Single-molecule FRET study of the sensory rhodopsin I – transducer complex (2014)
  • 著者名/発表者名: Ryo Nishimura, Keiichi Inoue, Jin Yagasaki, Kenichi Kawamoto, Yuki Sudo, Hideki Kandori
  • 学会等名: The 52nd Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
  • 発表場所: Sapporo, Japan
  • 年月日: 2014-09-25 – 2014-09-25
• [学会発表] Optical Control of the Gs-protein Activity by Microbial Rhodopsin Chimeras (2014)
  • 著者名/発表者名: Kazuho Yoshida, Keiichi Inoue, Takahiro Yamashita, Rei Abe-Yoshizumi, Kengo Sasaki, Yoshinori Shichida, Hideki Kandori
  • 学会等名: 16th International Congress of Photobiology
  • 発表場所: Córdoba, Argentina
  • 年月日: 2014-09-09 – 2014-09-09
• [学会発表] 細菌の走性における数的多様性の解明 (2014)
  • 著者名/発表者名: 井上圭一
  • 学会等名: 新学術領域研究「少数性生物学」第7回領域会議
  • 発表場所: 大津
  • 年月日: 2014-06-21 – 2014-06-21
• [学会発表] 光駆動型プロトンポンプから光ゲート型チャネルへの機能転換 (2014)
  • 著者名/発表者名: 井上圭一、下野和実、鈴木悠斗、谷ヶ崎仁、宮内正二、林重彦、神取秀樹、須藤雄気
  • 学会等名: 第41回生体分子科学討論会
  • 発表場所: 福岡
  • 年月日: 2014-06-07 – 2014-06-07
• [学会発表] The Sodium Pump Rhodopsin Discovered in Ocean (2014)
  • 著者名/発表者名: Keiichi Inoue, Hikaru Ono, Rei Abe-Yoshizumi, Yoshitaka Kato, Hiroyasu Ito, Susumu Yoshizawa, Kazuhiro Kogure, Hideki Kandori
  • 学会等名: Gordon Research Conference on “Photosensory Receptors & Signal Transduction”
  • 発表場所: Lucca, Italy
  • 年月日: 2014-04-09 – 2014-04-09
• [備考] 名古屋工業大学・研究者データベースシステム
  • URL: http://researcher.nitech.ac.jp/html/14_ja.html?l=ja&k=%E4%BA%95%E4%B8%8A&o=name-a&p=1
• [備考] 名古屋工業大学神取研究室・研究業績
  • URL: http://www.ach.nitech.ac.jp/~physchem/kandori/index_j.html