細胞集団中のマイノリティのジェノタイプを一細胞レベルで同定する方法の開発

2014 年度 実績報告書

• 研究領域: 少数性生物学―個と多数の狭間が織りなす生命現象の探求―
• 研究課題/領域番号: 26115719
• 研究機関: 独立行政法人理化学研究所
• 研究代表者: 城口 克之 独立行政法人理化学研究所, 統合生命医科学研究センター, 上級研究員 (00454059)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: １細胞解析 / シークエンサ / ハイスループット

研究実績の概要

１細胞の分解能を維持するためには、それぞれの細胞を空間的に分ける必要がある。そこで、細胞の濃度を適度に薄めて、ドロプレットに封入した。顕微鏡で確認したところ、数割のドロプレットに細胞が封入されていることが確認できた。
次のステップは、ドロプレット内でのゲノム配列（ターゲット部位）の増幅である。数百塩基対の配列のＰＣＲ増幅を試みたが簡単には増幅シグナルが得られなかったため、複数のプライマーを設計し、まずは通常のチューブ内のＰＣＲ反応で、１細胞からゲノム配列を増幅できるかを検討した。チューブ内で特異的に増幅できたプライマーを用い、さらに、様々なＰＣＲ条件を試し、ようやくドロプレット内の細胞からの増幅シグナルが得られた。増幅の検出には、増幅に依存して強度がます蛍光プローブを用いた。非特異的な増幅でないことを確認するため、ゲル電気泳動で増幅産物を確認したところ、長さが確かに設計と一致した。これにより、ドロプレット内の１細胞から、ゲノムＤＮＡの一部を増幅できることが確認された。
次に、各ドロプレットの増幅産物に、それぞれ異なるバーコード配列を結合することを試みた。様々な条件を試した結果、この結合は、プライマーの絶対濃度や相対濃度に大きく依存することが分かった。さらには、PCRのサイクル数や、温度条件にも、意外なかたちで依存した。最適な条件を検討したところ、増幅産物にバーコード配列が結合したことがゲル電気泳動の長さ解析から確認できた。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

ドロプレット内でのＰＣＲ反応や、増幅産物にバーコード配列を結合するところなどが、予期しない条件に依存するなど、解決に時間がかかる面もあった。しかし、丁寧に条件を検討することで乗り越え、全体としては、順調に研究が推進していると考えている。

今後の研究の推進方策

今後は、複数のターゲット部位を同時に増幅し、それらの増幅産物すべてにバーコード配列を結合できるようにする。さらに、たくさんの細胞を解析できるようにハイスループット化するため、たくさんのドロプレットを作製できるようにする。たくさんの細胞を解析できるようになったら、次世代シークエンサで配列を解析し、レアな細胞が同定できるかを検証する。