2016 Fiscal Year Annual Research Report
細胞内外における局所温度の最先端計測技術の開発と実践
| Project Area | Integrative understanding of biological phenomena with temperature as a key theme |
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| Project/Area Number |
15H05931
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
原田 慶恵 大阪大学, たんぱく質研究所, 教授 (10202269)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岡部 弘基 東京大学, 大学院薬学系研究科(薬学部), 助教 (20455398)
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| Project Period (FY) |
2015-06-29 – 2020-03-31
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| Keywords | 生物物理 / 細胞内温度計測 / 蛍光寿命イメージング / 蛍光性温度センサー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、温度と生物の関わりについて、細胞内局所温度変化という新規概念を導入することにより、基本的物理量である温度が細胞機能発現に貢献する原理の解明と、生物が高次の生命現象を発現しうるメカニズムの画期的解明を目的としている。これらの研究は、単独研究では成し得ず、細胞および生体において温度が重要な関与を示す現象への応用と拡張を領域内研究者と連携して行なっている。具体的な研究項目は以下の3つである。
1）細胞内温度計測および細胞内温度操作に関する最先端新技術の開発
2）細胞内局所温度が不均一性を保つメカニズムの解明
3）神経細胞内の温度計測・操作による高次生命機能との関わりの解明と生理的意義の解明
これまでに、高感度な細胞内温度イメージングを可能とする顕微鏡システムを構築し、計画研究班員との連携により、種々の培養細胞や培養神経細胞、脳スライスにおける温度イメージングを確立した。これを用いた細胞内温度の観察から、独自の細胞内温度計測法の適応範囲を劇的に向上したとともに、神経細胞内の局所や脳スライス内の細胞間に大きな温度の変動があることを発見した。また、細胞内局所を加熱する方法を開発し、細胞内の一過的加熱と緩和の計測を行うととともに、細胞内の局所的な加熱と不均一な温度勾配により駆動される現象を発見した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
細胞内局所温度の時空間的な変動に関して、以下の３項目を柱として研究を行った。
【1.細胞内局所温度計測法・操作法の開発】まず、FPTと蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)による細胞内温度計測法を応用して、近年開発された高感度かつ定量性の高い検出器を備えたFLIMシステムを構築した。さらに、細胞膜透過型の温度センサーを導入したことにより、任意の培養細胞内温度分布をイメージング解析することが可能となった。本法を用いて、細胞内温度センシング機構である脂質代謝や核－細胞質輸送における細胞内局所温度変動の関与を探索する共同研究を行っている。また、脳機能における細胞内温度変動の生理的意義の解明を目指して、神経細胞や脳組織における細胞内イメージング法を確立した。
【2.細胞内温度不均一性の原理】次に、細胞内局所温度の変動の原理を探った。これまでに計測した細胞内温度変動は、単純に単一細胞での発熱量と細胞内を均一水溶液と仮定した際の温度変動から著しい乖離がある。これを実験的に検証するため、人工熱源による一過的な温度変動の計測法を開発した。細胞内に一過的に与えた熱の緩和と細胞と同程度の大きさのリポソームでの結果を比較した結果、細胞内において著しく遅い熱緩和を発見した。
【3.温度シグナリングによる細胞機能】温度シグナリングを検討するため、一過的に形成するストレス顆粒（SG）に着目した。SGは、翻訳中mRNAを一時的に格納し、翻訳を止める機能を有する。ストレス条件下でのCOS7細胞内の温度計測、発熱阻害によるSG形成の時期選択的な阻害、ミトコンドリアからの発熱による一過的SG形成、IRレーザー照射を用いた細胞内局所定量的加熱時のSG形成の検討から、SG形成過程において細胞内の発熱がごく初期のSGコア形成に必須であること、細胞内の不均一な温度勾配がSG成長過程に必要である事を発見した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後も引き続き、下記の3つの研究項目を進める。特に、これまでに開発した温度計測・操作法をで細胞内の温度センシング機構と関連させることで細胞内の温度変動の原理と意義の解明を、また細胞内温度変動が生体の温度応答機構に与える影響を精査することにより、細胞内温度不均一性の生理学的意義を解明する。
【1.細胞内温度計測および操作法の開発】細胞内や細胞膜表面の局所温度を測定するため、ダイヤモンドナノ粒子内窒素－空隙中心（NVC）を用いた温度計測法を開発・改良する。また、神経細胞や脳スライスにおける温度計測法の開発を完成させる。また、温度操作法としては、これまでに開発した金粒子を用いた細胞内局所加熱法を応用して、金ナノ粒子を特定の分子や細胞小器官に結合させることで、分子選択的に加熱する方法へ発展させる。また、赤外レーザー照射や金ナノ粒子を用いて脳スライス内の局所加熱法を開発する。
【2.細胞内の温度不均一性のメカニズムと機能の解明】これまでに開発した各種培養細胞内温度計測法を用いて、形質膜表面におけるTRPチャネル依存的な局所温度変動機構（富永・内田と共同）、運動中の線虫一個体での温度イメージング（久原と共同）、核と細胞質の温度差が形成されるメカニズム、ミトコンドリア近傍の温度感知と脂肪酸を介した細胞内温度恒常性の解明を行う。
【3.神経細胞内における温度計測および操作】分散培養した神経様細胞、ニューロンや脳スライスの細胞内温度イメージング法を駆使することにより、視索前野での体温調節、視交叉上核でのリズム調節、脳内温度感知機構に応用することで、細胞内および細胞間の温度不均一性の生理的意義を解明する。
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Research Products
(8 results)
