2018 Fiscal Year Annual Research Report
温度による行動制御の基盤となる快・不快情動生成機構の解明
| Project Area | Integrative understanding of biological phenomena with temperature as a key theme |
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| Project/Area Number |
15H05934
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
南 雅文 北海道大学, 薬学研究院, 教授 (20243040)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
柴崎 貢志 群馬大学, 大学院医学系研究科, 准教授 (20399554)
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| Project Period (FY) |
2015-06-29 – 2020-03-31
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| Keywords | 脳・神経 / 神経科学 / 環境 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまでに神経活動マーカーcFosの免疫染色により、暑熱・寒冷環境において視床室傍核が活性化することを明らかにしてきた。本年度は、視床室傍核の下流経路を明らかにするため、快・不快情動に関与する側坐核、扁桃体中心核、分界条床核に着目し、これらの脳領域に投射する神経細胞を逆行性に標識した。その後、暑熱・寒冷環境暴露による視床室傍核での神経細胞活性化をcFos免疫染色により可視化した。暑熱・寒冷環境暴露により側坐核、分界条床核、扁桃体中心核に投射する視床室傍核神経細胞が活性化することが明らかとなった。定量的な解析を行ったところ、視床室傍核のcFos陽性神経のうち、側坐核、分界条床核、扁桃体中心核に投射しているものは、暑熱環境では、56.1％、50.5％、20.9％、寒冷環境では、40.0％、48.1％、24.0％であった。さらに、暑熱・寒冷環境曝露中の視床室傍核の神経活動を小型蛍光顕微鏡を用いたカルシウムイメージング法によりリアルタイムに計測する実験系を構築した。また、領域内の坂口班との連携により、温度感受性蛍光プローブtsGFPを活用した脳内温度計測法の開発に着手した。2019年度の研究において、ファイバーフォトメトリー法により温度選択行動中の動物の脳内温度変化と神経活動変化を同時計測する実験系を構築することを目指す。脳浮腫領域では乳酸アシドーシスに伴う約２℃の異常発熱が起こっており、これがTRPV4を異常活性化させ浮腫病態を増悪することを見いだした（岡部班との連携成果）。また、グリア細胞が浮腫を起こした際に、体温にプラスして浮腫に伴う膜伸展刺激が生じることがTRPV4の異常活性化を引き起こし、サイトカイン放出を惹起し、神経細胞死を引き起こすことを見いだした（ルーベン大学・ユタ大学との国際連携研究成果）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
暑熱・寒冷環境暴露により側坐核、分界条床核、扁桃体中心核に投射する視床室傍核神経細胞が活性化することを明らかとし、定量的な解析も行った。さらに、暑熱・寒冷環境曝露中の視床室傍核の神経活動を小型蛍光顕微鏡を用いたカルシウムイメージング法によりリアルタイムに計測する実験系を構築した。また、領域内の坂口班との連携により、温度感受性蛍光プローブtsGFPを活用した脳内温度計測法の開発に着手した。2019年度の研究において、ファイバーフォトメトリー法により温度選択行動中の動物の脳内温度変化と神経活動変化を同時計測する実験系を構築することを目指す。脳浮腫領域では乳酸アシドーシスに伴う約２℃の異常発熱が起こっており、これがTRPV4を異常活性化させ浮腫病態を増悪することを見いだした（岡部班との連携成果）。また、グリア細胞が浮腫を起こした際に、体温にプラスして浮腫に伴う膜伸展刺激が生じることがTRPV4の異常活性化を引き起こし、サイトカイン放出を惹起し、神経細胞死を引き起こすことを見いだした（ルーベン大学・ユタ大学との国際連携研究成果）。以上より、研究はおおむね順調に進展していると判断できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
神経活動マーカーc-Fosの発現解析により、視床室傍核から快・不快情動生成に関与する側坐核、分界条床核、扁桃体中心核に投射する神経が暑熱・寒冷環境曝露により活性化することを明らかにしている。しかしながら、c-Fosタンパク質発現を指標とした免疫組織学的解析では、時間分解能が低く神経細胞活性化の時間経過を詳細に解析することが困難であり、また、暑熱環境曝露と寒冷環境曝露で同じ神経細胞が活性化するのか、あるいは、刺激により異なった神経細胞が活性化するのかについても明らかにすることができない。そこで今年度の研究では、小型蛍光顕微鏡を用いて、暑熱・寒冷環境曝露中の神経活動をカルシウムイメージングによりリアルタイムに計測する。この方法により１つ１つの神経細胞の活動を経時的に記録することができ、各神経細胞がどのような刺激により、どのような時間経過で活性化するのかを明らかにすることができる。さらに、昨年度に引き続き、領域内の共同研究により温度感受性蛍光プローブtsGFPを活用した脳内温度計測法を開発する。ファイバーフォトメトリー法を用いて、温度選択行動中の動物の脳内温度変化と神経活動変化の同時計測を試みる。研究分担者の柴崎は、培養アストロサイトにおける温度感受性蛍光プローブtsGFPの温度計測機能を検証するとともに、アストロサイト特異的TRPV4ノックアウトマウスの急性海馬スライス標本を用いて、カルシウム活動・細胞代謝・細胞内温度に野生型マウスとの違いがどの程度あるのかを調べる。カルシウム活動はYC nano3.1、細胞代謝はGO-ATeamを用いたFRET計測にて調べる。細胞内温度分布はFPTあるいはtsGFPによる蛍光変化計測にて調べる。
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