2016 Fiscal Year Annual Research Report
The development of fundamental bioimaging technologies for comprehensive understanding
| Project Area | Resonance Biology for Innovative Bioimaging |
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| Project/Area Number |
15H05948
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
宮脇 敦史 国立研究開発法人理化学研究所, 脳科学総合研究センター, チームリーダー (80251445)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
牧 昌次郎 電気通信大学, 大学院情報理工学研究科, 助教 (20266349)
下薗 哲 国立研究開発法人理化学研究所, 脳科学総合研究センター, 研究員 (40391982)
阪上 朝子 国立研究開発法人理化学研究所, 脳科学総合研究センター, 研究員 (90462689)
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| Project Period (FY) |
2015-06-29 – 2020-03-31
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| Keywords | バイオイメージング / 共鳴エネルギー移動 / 細胞周期 / レチノイン酸 / 個体イメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
phase separation（水と油の例にみられる相分離）を利用し、生きた細胞内でタンパク質間相互作用（PPI：protein-protein interaction）をイメージングする手法Fluoppiを開発した。Fluoppiは、多量体蛍光タンパク質の欠点を逆用し、PPIを境界明瞭なliquid phase dropletとして可視化する手法である。
Fluoppiの実証実験を行い、p53とMDM2、FKBPとFRB、SmacとXIAP、HRasとcRaf、CalmodulinとM13などの相互作用の制御を秒単位の時間分解能でモニターできることを示した。こうした高い時間分解能はliquid phase dropletの動的内部構造によることを、蛍光の褪色や色変換に続く時間分解解析によって、証明することができた。さらに、４量体蛍光タンパク質AGの代わりに単量体蛍光タンパク質mAGを使用することで、観察対象(X)のホモ２量体化をモニターする手法、homoFluoppiを開発した。EGF刺激によっておこるERK2の２量体化を初めて生きた細胞内で観察することに成功し、ERK2の２量体形成はパルス状に起こること、細胞ごとにそのタイミングや回数が異なることを示した。従来法のように何万個の細胞を磨り潰すアプローチでは捉えることが難しい現象であることが判明した。
本手法はPPI阻害薬の評価に適しており、今後、PPI創薬研究を飛躍的に加速させることが期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
「生体深部イメージング」「ストレスイメージング」「ズーミングインアウト」についてバイオイメージングの要素的技術を開発してきた。「生体深部イメージング」については、新しい生物発光システムの構築を目指し、計画研究分担者の牧らとともに、新しい発光基質・酵素の開発を行った。新基質のマウス個体における分布の時間変化および、新基質に対応する酵素の分子進化を精力的に進めている。新基質合成については計画研究班の松田グループの分担者である築地らとも共同研究を進めている。またレチノイン酸濃度を包括的にマッピングするプロジェクト”RAome”を発足し、計画研究班の横田グループの３次元顕微鏡を利用してGEPRA (Genetically Encoded Probe for Retinoic Acid) のFRETシグナルをマウス個体全体に渡って再構成する試みを行っている。心臓、胸腺、下垂体、副腎、嗅覚器におけるレチノイン酸濃度勾配を発見した。「ストレスイメージング」については、遺伝子でコードされる（タンパク質性の）酸化ストレスプローブ（Nrf2のデグロンを利用）を作製し、酸化ストレスが検出できるような細胞種、培養条件などの検討を行った。また細胞周期（Fucciで可視化）との関連を探ることを目的にマルチカラー化を図った。ストレスの多様性を鑑み、ほかのストレスプローブと比較しながら我々の酸化ストレスプローブの検出スペクトルを調べることを行っている。対照として計画研究班の神谷グループが開発したグルタチオン還元・酸化平衡センター化を利用している。「ズーミングインアウト」については、平成２７年度に発表した組織透明化試薬ScaleSの改良版であるScaleS+を作製し、透明度および蛍光シグナル保持の向上を達成した。
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| Strategy for Future Research Activity |
生きた細胞で生体分子相互作用を可視化するための技術Fluoppiの原理phase transitionを利用して、バイオイメージングの多様な要素技術を開発する予定である。phase transitionは、“核小体”や“Ｐ顆粒”など核酸とタンパク質を含む小器官の研究を通して、数年前から注目されるようになり、ただし欧米に比べて日本ではまだ認知が遅れている。Fluoppiはタンパク質のみでphase transitionを検出・制御する独自のシステムであり、これを様々な蛍光タンパク質技術と組み合わせていく。我々が独自に開発した蛍光タンパク質を組み入れることで、産業界への普及も狙う。「生体深部イメージング」については、新しい生物発光システムの有効性を、ネズミや非ヒト霊長類動物などを使って証明していく。また生体深部蛍光イメージングについては、２光子励起顕微鏡観察における蛍光回収効率を上げる工夫を行う。「ストレスイメージング」については、酸化ストレスプローブを発現するマウス個体を作製し、組織、器官、個体レベルで酸化ストレスのパターンを解析する。この過程でストレスの多角的理解を目標に他のプローブ（ＤＮＡ損傷、オートファジーなど）との併用を進め、領域内にある様々なプローブを体系的に試すような仕組みを作る。「ズーミングインアウト」については、大容量の画像データを保存、管理、解析するノウハウや、３次元再構成の画像をうまく可視化する技術の開発と普及に努め、また、大規模な３次元空間において解剖学的道しるべを簡単に作成する技術を発表していく。こうした活動によって、大規模３次元観察の技術革新が健全に進展すると思われる。
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Research Products
(7 results)
