2018 Fiscal Year Annual Research Report
高機能性生体分子の創成をめざした生合成マシナリーの基盤解明
| Project Area | Creation of Complex Functional Molecules by Rational Redesign of Biosynthetic Machineries |
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| Project/Area Number |
16H06452
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
大利 徹 北海道大学, 工学研究院, 教授 (70264679)
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| Project Period (FY) |
2016-06-30 – 2021-03-31
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| Keywords | 多価不飽和脂肪酸 / 生合成酵素 / アミド結合形成酵素 / ペプチドグリカン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
①多価不飽和脂肪酸（PUFA）生合成酵素の精密機能解析
海洋微生物由来の4つの巨大遺伝子からなるエイコサペンタエン酸（EPA; C20,ω3）、ドコサヘキサエン酸（DHA; C22,ω3）、アラキドン酸（ARA; C20,ω6）生合成遺伝子を大腸菌で異種宿主発現させ各々のPUFAが生産されることを確認した。次いで、遺伝子交換とドメイン交換によりω3位の二重結合の生成に関与するドメインと炭素鎖長の制御に関与するドメインをそれぞれ同定した。また、化学合成した基質と同定したドメインの組換え酵素を用いたin vitro実験により、それらの制御機構の詳細を明らかにした。さらに得られた知見に基づき、真核微細藻類の実用DHA合成酵素を論理的にEPA合成酵素に改変することに成功した。
②新規アミド結合形成酵素
ペプチドグリカンの生合成に関与する新規酵素UDP-MurNAc-L-Ala-L-Glu 生合成酵素(MurD2)は基質としてL-Gluを用いるが、MurD2と27％の相同性を有する大腸菌のMurDはD-Gluを用いる。そこでMurDの結晶構造を基にMurD2の基質（L-Glu）認識に関与するアミノ酸残基を推定し、対応するMurDのアミノ酸に置換した結果、2アミノ酸置換によりD-Gluのみを基質にする酵素に変換することに成功した。しかし逆に、MurDの上記2アミノ酸を対応するMurD2のアミノ酸残基に置換した変異酵素は、D-Gluのみを基質とし特異性に変化は見られなかった。そこで、MurDの基質特異性がL-Gluに改変された場合にのみ生育する大腸菌を構築し探索した結果、1アミノ酸置換で微弱ではあるがL-Gluに活性を示す変異酵素を得た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
多価不飽和脂肪酸（PUFA）生合成酵素の精密機能解析に関しては、ω3位の二重結合の生成に関与するドメインと炭素鎖長の制御に関与するドメインを同定し、化学合成した基質と組換え酵素を用いたin vitro実験により詳細な生合成メカニズムも明らかにした。さらに得られた知見を活用し生合成リデザインによるDHA生合成酵素からEPA生合成行への改変にも成功し当初の計画以上に進展している。
アミド結合形成酵素に関しては、ペプチドグリカンの生合成に関与するMurD2酵素の解析はほぼ終了し、ペアとして働くMurL（UDP-MurNAc-L-Ala-L-Gluの末端L-Glu異性化酵素）の反応機構解明のための結晶構造も得られつつある。
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| Strategy for Future Research Activity |
多価不飽和脂肪酸（PUFA）生合成酵素の精密機能解析に関しては、真核微細藻類のDHA合成酵素の解析を行う。これまでに解析した海洋微生物由来のDHA、EPA、ARA合成酵素はω3かω6の何れか一方のみを生合成するのに対し、真核微細藻類のDHA合成酵素は、ω3のDHAとω6のDPA（ドコサペンタエン酸）を併産する。したがって、微生物由来酵素とは異なる制御機構の存在が示唆されるため、これまで用いてきた手法で解明する。
ペプチドグリカンの生合成に関与する新規酵素UDP-MurNAc-L-Ala-L-Glu 生合成酵素(MurD2)の基質認識機構の解析を終了したので、引き続き新規アミド結合形成酵素の探索と機能解析を行う。
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