2018 Fiscal Year Annual Research Report
Understanding of chemical communications and higher-order functional evaluation of bioactive ligands by spatiotemporal analysis
| Project Area | Frontier research of chemical communications |
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| Project/Area Number |
17H06409
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
菊地 和也 大阪大学, 工学研究科, 教授 (70292951)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2022-03-31
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| Keywords | 化学プローブ / 破骨細胞 / 内在性膜タンパク質 / 時空間解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、これまで開発してきた化学プローブを用いた時空間解析技術を統合し、天然・人工リガンドとなる化合物の動作原理を可視化して示すことを目的とする。測定したい分子との反応に着目して化学プローブをデザインするという発想を基に、時間を特定して標的となる生体分子に機能性蛍光分子を導入する原理を開発する。分子認識あるいは酵素反応といった生体内で起こる反応を分光情報（蛍光特性変化等）へ変換できる化学プローブをデザイン・合成する。開発した化学プローブを応用して、分子リガンドの機能を時空間的に解明するための技術プラットフォームを確立する。本プラットフォームを基盤として、本領域における分野融合研究を推進し、新規生物活性リガンドの高次機能評価・スクリーニングを行い、「化学コミュニケーション」の統合的理解を深める。
具体的な例としては、破骨細胞の骨吸収活性をイメージングする化学プローブの開発、内在性膜タンパク質（GPCR）のリガンド結合に伴う構造変化をイメージングできる化学プローブの開発を中心に取り組む。本年度は、前年度に新たに開発した赤色蛍光プローブを用いて、破骨細胞活性のイメージングを行った。破骨細胞は骨組織を溶解し、骨組織の再構築を行っており、その異常な活性は骨粗しょう症や関節リウマチの原因になることが指摘されている。破骨細胞は酸を放出することで骨を溶解するため、低pHで光る蛍光色素によってその活性をイメージングすることが可能と考えられる。pH応答性、非応答性の赤色蛍光プローブを用いたイメージング結果により、骨溶解時に作られる低pH領域を選択的に検出、追跡できるかどうかを確かめた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
前年度までに開発したローダミンスピロラクタム型の赤色蛍光色素を基にしたpH応答性蛍光プローブを用いて、マウス体内における骨組織の低pH領域の検出・追跡を行った。二光子励起顕微鏡を用いて、マウスの骨髄腔を観察したところ、骨組織表面の一部からプローブ由来の蛍光シグナルが見られた。一方で、pH非応答性の蛍光プローブを用いた観察では、骨組織表面から一様な蛍光シグナルが見られたため、低pH環境を選択的に可視化できていることが示された。さらに、プロトンポンプをGFPで標識したマウスを用いて、開発した赤色蛍光プローブとのマルチカラーイメージングを行ったところ、プロトンポンプの局在変化に伴い、酸性領域が広がっていく様子を捉えることに成功した。実際にプロトンポンプの機能を阻害する薬剤を投与したところ、投与後徐々に蛍光が減衰していく様子を観察することができ、時空間を制御して薬剤の効果をin vivoにおいて評価できる系を構築できた。また、同様のイメージング系により、破骨細胞の代謝系に作用し、骨吸収活性を抑える薬剤の評価にも適用できることが示された。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、内在性膜蛋白質のリガンド結合に伴う構造変化をイメージングできるプローブの開発に取り組む。これまでの蛍光標識抗体を用いた技術では達成できなかった、生きた細胞におけるGPCRなどの内在性膜蛋白質機能の可視化を行う。そのために、小分子・蛋白質ハイブリッドプローブを開発する。蛋白質は標的となる内在性膜蛋白質を特異的に認識するユニットにラクダ科動物由来抗体断片（13 kDa）であるNanobodyを選択する。一方で、標的結合時に蛍光強度を上昇させる蛍光スイッチ小分子として、細胞膜に結合する環境応答性蛍光色素であるNile redを用いる。両要素を当研究室で開発されたPYPタグを用いた蛋白質ラベル化技術と統合するため、PYPリガンド-Nile red連結ラベル化小分子を開発する。上記分子を用いて小分子・蛋白質ハイブリッドプローブを創製する。ハイブリッドプローブのNanobody部位が標的膜蛋白質に結合すると、Nile redが細胞膜に近接、結合し蛍光強度が上昇することが期待できる。ハイブリッドプローブの合成、評価を進め、β2-ARなどに代表されるGPCRの薬剤による機能発現をイメージングによって検出する系を確立する。
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