2019 Fiscal Year Annual Research Report
Understanding of chemical communications and higher-order functional evaluation of bioactive ligands by spatiotemporal analysis
| Project Area | Frontier research of chemical communications |
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| Project/Area Number |
17H06409
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
菊地 和也 大阪大学, 工学研究科, 教授 (70292951)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2022-03-31
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| Keywords | 化学プローブ / 破骨細胞 / 内在性膜蛋白質 / 時空間解析 / 蛍光イメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、これまで開発してきた化学プローブを用いた時空間解析技術を統合し、天然・人工リガンドとなる化合物の動作原理を可視化して示すことを目的と する。測定したい分子との反応に着目して化学プローブをデザインするという発想を基に、時間を特定して標的となる生体分子に機能性蛍光分子を導入する原理 を開発する。分子認識あるいは酵素反応といった生体内で起こる反応を分光情報（蛍光特性変化等）へ変換できる化学プローブをデザイン・合成する。開発した 化学プローブを応用して、分子リガンドの機能を時空間的に解明するための技術プラットフォームを確立する。本プラットフォームを基盤として、本領域におけ る分野融合研究を推進し、新規生物活性リガンドの高次機能評価・スクリーニングを行い、「化学コミュニケーション」の統合的理解を深める。 具体的な例としては、破骨細胞の骨吸収活性をイメージングする化学プローブの開発、内在性膜タンパク質（GPCR）のリガンド結合に伴う構造変化をイメージン グできる化学プローブの開発を中心に取り組む。
本年度は、骨組織の細胞挙動を探る新たなイメージングプローブの開発に取り組んだ。骨組織表面だけでなく、深部に送達されるようビスフォスホネート構造を骨ミネラル成分であるヒドロキシアパタイトへの結合が弱いリセドロネートを導入し再設計した。pH応答性、及び非応答性のプローブを合成し、それぞれの蛍光強度のpH変化による挙動を調べた。内在性膜蛋白質のリガンド結合に伴う構造変化をイメージングできるプローブの開発においては、細胞膜に結合する環境応答性蛍光色素であるNile redを用い、当研究室で開発されたPYPタグリガンドと連結した蛋白質ラベル化プローブを合成した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度は骨組織の細胞挙動を探るイメージングプローブにおいて、従来の破骨細胞だけでなく、より深部に位置する骨細胞の活性を検出可能なプローブをデザイン、合成することができた。また、内在性膜蛋白質の機能をイメージングできるプローブ開発も順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、骨細胞の機能を可視化するために二光子励起顕微鏡を用いたイメージングを行う。骨組織表面だけでなく、より組織内部の骨小腔に焦点を当ててイメージングを行うことで、骨細胞の機能を可視化する。骨小腔のpHを可視化することで、骨細胞による骨組織の吸収（骨細胞性骨溶解）の検出を目指す。また、生理活性リガンドによって骨小腔のpHがどのように変わるかをイメージングによって明らかにする。内在性蛋白質のイメージングについては、標的となる内在性膜蛋白質を特異的に認識するラクダ科動物由来抗体断片（ナノボディ）を用い、当研究室で開発したPYPタグを融合発現させた蛋白質を調製する。ここに、標的結合時に蛍光強度を上昇させる環境応答性色素を用いたプローブを結合させることで、小分子・蛋白質ハイブリッドプローブを創製する。ハイブリッドプローブのナノボディが標的膜蛋白質を認識すると、色素が細胞膜に近接、結合し蛍光強度が上昇すると考えられる。このプローブを応用し、内在性膜蛋白質の機能をイメージングによって検出する系を確立する。
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