2019 Fiscal Year Annual Research Report
Molecular mechanisms and physiological functions of plasma membrane component degradation in animal development
| Project Area | Multimode autophagy: Diverse pathways and selectivity |
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| Project/Area Number |
19H05711
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
佐藤 健 群馬大学, 生体調節研究所, 教授 (30311343)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2024-03-31
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| Keywords | 細胞膜分解 / エンドサイトーシス / 受精 / 卵 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
まず線虫の初期胚において細胞膜タンパク質等の動態を観察するため、CAV-1-GFPに加え、線虫における精子レセプターであるEGG-1、PatchedホモログであるPTC-1、葉酸受容体ホモログであるFOLT-1等にGFPを融合したタンパク質を生殖腺において発現する遺伝子組み換え線虫を作製し、受精前後におけるこれらの細胞内に動態について解析を行った。その結果、EGG-1、PTC-1は受精後にエンドサイトーシスされ分解されるのに対し、FOLT-1は受精後も細胞膜上に検出された。このことから、卵母細胞膜タンパク質の中にも分解されやすいものとされにくいものの選択性があることが明らかとなった。また、線虫の受精前後から初期発生過程にかけて長時間・高解像ライブイメージング観察を行う条件を検討し、タンパク質やオルガネラの動態を卵の成熟から胚発生まで非侵襲的に観察できる系を構築した。さらに、細胞膜分解関連因子を探索するために、CAV-1-GFP発現線虫に対してRNAiライブラリーを用いた網羅的スクリーニングを行ったところ、発現抑制するとCAV-1-GFPが初期胚において後期エンドソームに蓄積し、分解されなくなる新規因子を同定した。この因子の阻害により、後期エンドソームが肥大化しユビキチン化タンパク質の蓄積も観察されたことから、受精後に後期エンドソームの活性を制御する因子であることが示唆された。一方、マウス卵においてもタンパク質やオルガネラの動態を受精前後から胚盤胞期まで非侵襲的に高解像ライブイメージングする観察系を確立した。また、マウスの未受精卵を多量に採取し質量分析を行うことにより、未受精卵に発現する多数の膜タンパク質の同定に成功した。現在、マウス卵の細胞膜に存在するCD9やアミノ酸輸送体等の受精前後における動態に着目し、研究を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
線虫及びマウスの初期胚発生過程を非侵襲的かつ高解像でライブイメージングする実験系の構築に成功しており、受精前後における細胞膜タンパク質分解の素過程を捉えることに成功しつつある。線虫においては受精後の細胞膜分解に関わる新規因子の網羅的スクリーニングにより複数の候補因子を同定しており、今後これらの解析を通じて分子メカニズムが明らかになることが期待される。一方、マウス卵においては未受精卵タンパク質の質量解析により、多数の膜タンパク質の同定に成功している。今後、これらのうち細胞膜タンパク質に焦点をあて、受精前後における細胞内動態や分解過程を明らかにすることにより、種を超えた細胞膜分解メカニズムが明らかになると思われる。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1) 線虫の初期胚におけるリソソーム分解系活性化プロセスの解析
前年度に引き続き、初期発生過程における細胞膜タンパク質やオルガネラの動態を観察するためのモニター動物の作製を行う。特に初期発生の時間軸に沿ったリソソーム分解系活性化を観察するために、エンドサイトーシスによる細胞膜分解とオートファジーの活性化を同時に観察可能なモニター動物を構築し、長時間・高解像ライブイメージングを行い、リソソーム分解系活性化プロセスを明らかにする。
(2) 線虫の卵母細胞膜分解に関与する因子の探索と解析
前年度に単離した卵母細胞膜タンパク質の分解に関わる候補因子について、定法にしたがい、解析を行う。まずRNAi法により遺伝子ノックダウンを行い、CAV-1-GFPだけではなくその他の細胞膜タンパク質の分解や動態にも関与するのか、検討する。また、候補因子に蛍光タンパク質を結合した融合タンパク質を発現する線虫の構築や抗体の作製を通じて、受精前後における細胞内動態について解析する。さらに、候補因子の遺伝子破壊株を獲得し、その表現型について詳細に解析する。
(3) マウス配偶子及び初期胚における長時間高解像ライブイメージング解析
前年度の条件検討の結果、蛍光タンパク質で標識されたオルガネラタンパク質の挙動をマウス卵において低侵襲的かつ高解像度でライブイメージングする系の確立に成功した。そこで本年度は、線虫およびマウス受精卵における各オルガネラの動態解析によって得られた情報を集約し、発生の時間軸に沿った細胞膜タンパク質と各オルガネラの４次元マッピングを行う。また、これらの解析により、マウスの発生の時間軸における細胞膜分解系とその他のオートファジー分解系の活性化のタイミングを明らかにする。
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