2019 Fiscal Year Annual Research Report
生命金属動態の理解に向けた金属イオンConditionalプロテオミクス法の開発
| Project Area | Integrated Biometal Science: Research to Explore Dynamics of Metals in Cellular System |
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| Project/Area Number |
19H05764
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
田村 朋則 京都大学, 工学研究科, 講師 (10746639)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2024-03-31
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| Keywords | コンディショナルプロテオミクス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は生体内の高濃度Zn2+環境下に局在するタンパク質群を特異的に同定・解析することを目的とし、「Zn2+コンディショナルプロテオミクス法」を開発した。この手法では、細胞内遊離Zn2+に結合して反応性が向上するタンパク質修飾試薬（ラベル化剤）を用いる。ラベル化剤は、細胞内の高濃度Zn2+環境下で活性化され、その領域に存在するタンパク質と反応する。この反応に基づいて検出用あるいは精製用のプローブをタンパク質に導入することで、ウエスタンブロットや液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置（LC-MSMS）を用いて高濃度Zn2+環境下に存在するタンパク質を網羅的に同定・解析することが可能である。
一方、従来のZn2+応答性ラベル化剤（AIZin）はZn2+に対する親和性が非常に強く(Kd = 0.9 nM)、試料中に存在する極微量のZn2+にも応答してしまうため、適用する実験系によってはラベル化のバックグラウンドシグナルが高くなるという問題があった。そこで本研究ではこれらの問題を克服するために、Zn2+結合部位である金属配位子の構造を変換し、Zn2+に対する親和性(Kd)がnano-micro molarとなるような複数のラベル化剤を新たに合成した。具体的には、Zn2+結合部位であるDipicolylamineのpyridine部位を様々な構造に変換した化合物群を合成した。このように幅広いZn2+親和性を示すラベル化剤のラインナップを揃えることで、生体組織や動物/植物中のZn2+濃度に適したラベル化剤選択が可能となると期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
亜鉛イオンに加えて、他の金属イオンに応答して活性化し反応性が上昇する新規ラベル化剤の開発を進め、実際に銅イオンに応答する新規プローブの開発に成功した。また、本研究から派生して一酸化窒素および過酸化水素コンディショナルプロテオミクス用のプローブの開発に成功した。加えて、当初計画にはなかった新規プロテオミクス手法として光駆動型近傍ラベリングの開発にも成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度開発したZn2+応答性ラベル化剤を様々な疾患モデルに適用し、生命金属関連タンパク質の機能解明ならびに疾患との関連性を明らかにする。また、引き続き銅イオン応答型プローブの開発を進め、実用レベルにまでプローブ性能を改善する。さらに光駆動型近傍ラベリングを脳スライスなどの組織レベルでも使用出来るように系をブラッシュアップし、金属関連タンパク質が関与するインタラクトーム解析へと展開する。
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