2021 Fiscal Year Annual Research Report
Development of functional Raman probes for innovative multiplex imaging
| Project Area | Innovative multiplex imaging with functional Raman probes |
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| Project/Area Number |
20H05724
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
神谷 真子 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 准教授 (90596462)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小嶋 良輔 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 助教 (10808059)
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| Project Period (FY) |
2020-10-02 – 2023-03-31
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| Keywords | ラマンプローブ / 多重検出 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度までに確立した分子設計の拡張を目指し、9CNピロニン誘導体の9位ニトリルをアルキンに置換した誘導体を複数開発し、その吸収特性・ラマンスペクトル特性および安定性について評価した。その結果、これらの誘導体は、十分なラマン信号増強が期待でできる前期共鳴条件にあたる長波長吸収を示し、実際にDMSO中においては、cell silent領域において9CNピロニン誘導体と分離検出可能なラマンピークを示すことを確認した。一方で、緩衝液中においては、時間とともに長波長の吸光度が低下し不安定であることが示唆されるとともに、ラマンピーク形状がinverse型やdisperse型で検出される傾向があることが明らかとなった。これは、DMSO中に比べて緩衝液中の方が吸収スペクトルがブロード化し、真正共鳴条件に由来する大きな共鳴バックグラウンドが生じたためと考察された。
また、キサンテン環以外の色素骨格を母核とした新たなラマンプローブの開発にも取り組んだ。具体的には、分子内求核基を有するクマリンーシアニンハイブリッド色素の様々な置換位置に、アルキンやニトリルなどのラマンタグを導入した一連のパイロット化合物を合成し、その吸収特性・ラマンスペクトル特性について評価した。その結果、短波長吸収の閉環体（非共鳴）と長波長吸収の開環体（前期共鳴）からなるスピロ環化平衡を示し、前者と比較して後者でラマン信号が増大するという期待通りの結果が得られた。
また、開発したラマンプローブを用いた組織染色の予備実験として、小幡班と共同して、光分解性保護基を導入したケージド蛍光団を用いた光ラベル化実験を行い、活性中間体としてキノンメチドを生成するプローブを用いた場合に特異的かつ高い細胞内滞留性での光ラベル化が達成可能であることを示した（Chem. Commun. 57: 5802-5805 (2021)）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
2021年度においては、2020年度までに開発した9CNピロニン誘導体のニトリルをアルキンに置換することでラマンシフト値の拡張を図ったが、緩衝溶液中における安定性の低さやラマンピーク形状（inverse型やdisperse型）から、緩衝溶液中での多重検出に適さないことが示唆される結果となった。一方で、疎水性環境であれば、シャープなピーク形状かつ安定的な検出が可能であったため、本骨格に基づき、標的蛋白質にラベル化されて初めてラマン信号を発する環境応答型ラマンプローブなどが開発できることが示唆される結果となった。
また、キサンテン以外の色素骨格についてラマンプローブ母核としての可能性を検討したところ、例えばクマリンーシアニンハイブリッド色素に組み込んだニトリルのラマン信号は分子内スピロ環化平衡により制御できることが示された。9CNピロニン誘導体を母格としたラマンプローブでは、アミドからアミンへの変化に伴う長波長化をラマン信号増強原理として利用したが、今回の検討から、ラマン信号のスイッチング機構としてスピロ環化平衡を用いることができる可能性が示された。9CNピロニン誘導体と比較するとS/B比が低下するものの、分子内スピロ環化平衡に基づく吸光度変化は、様々な蛍光プローブの蛍光制御原理として活用されているため、本知見を活用することで、新たな原理に基づく機能性ラマンプローブの開発につながることが期待できる結果となった。
これらの成果は、今後の研究方針を考える上で重要な知見であり、また当初目標としていた計画以上の成果であったため、上記の評価とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度開発した、9位にアルキンを導入したピロニン誘導体、ニトリルを導入したクマリンーシアニンハイブリッド色素の特性を考慮して、新たなラマンプローブを開発する。具体的にはまず、前者は蛋白ラベル化色素として、後者はpHプローブとして、in vitroおよび細胞を用いて機能を検証する。
また、本年度の検討から、9CNピロニン誘導体のラマンスペクトルのシャープさ、S/B比やRIEの高さは大きなアドバンテージであり、9CNピロニンを更に構造展開する価値が十分にあると考えられる。そこで今後は、9CNピロニン骨格のアミノ基をヒドロキシ基に変換することでO-function型プローブの開発も目指す。プレ検討の結果から、ヒドロキシ基への変換により、凝集性が高くなることが明らかとなったため、この凝集性をうまく活用することで、組織中の標的酵素を発現する領域を特異的に検出可能な新規ラマンプローブの開発を目指す。
また、多重超解像イメージングに資するラマンプローブとして、「光スイッチング機能を示すラマンプローブ」の開発にも取り組む。具体的には、代表的なフォロクロミック色素であるジアリールエテン骨格に、アルキンやニトリルなどのラマンタグを導入した化合物を合成し、光照射により “開環フォーム（非共鳴）”と“閉環フォーム（前期共鳴）”がスイッチングすることで、ラマン信号が光制御可能な分子を開発する。目的の特性を示す分子が開発できたら、ニトリル基の同位体標識によるラマンシフトの調整やオルガネラ標的リガンドの導入を行い、細胞透過性・細胞内局在の評価を行うとともに、ラマン信号強度が光スイッチングするか、またその検出感度について精査する。
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