2020 Fiscal Year Annual Research Report

Elucidation of intramolecular heat transfer mechanism for construction of highly effective photothermal protein heaters

Planned Research

Project Area	Next-generation non-invasive biological deep-tissue manipulation by biomolecular engineering and low physical energy logistics
Project/Area Number	20H05756
Research Institution	Osaka University
Principal Investigator	水野操大阪大学, 理学研究科, 助教 (10464257)
Project Period (FY)	2020-10-02 – 2023-03-31
Keywords	振動エネルギー移動 / アンチストークスラマン散乱 / ヘムタンパク質 / タンパク質ヒーター
Outline of Annual Research Achievements	熱は細胞内において情報伝達因子である。熱シグナルによる情報伝達の機構解明と制御のためには、細胞内での効率的かつ部位選択的な加熱技術が求められている。本研究では、外部からの光エネルギー入力によって高効率で熱シグナルを生み出す分子ヒーターとして働くタンパク質（タンパク質ヒーター）を開発する。タンパク質ヒーターのプロトタイプとして、ヘムタンパク質に着目する。ヘムは光励起により発生した余剰振動エネルギーにより、その近傍の温度を過渡的に上昇させる。本研究では、ヘムで発生した余剰振動エネルギーがタンパク質分子内を移動する過程を、エネルギー分布の時空間マッピングすることで、タンパク質分子内熱伝導機構を明らかにする。タンパク質分子内を移動する余剰振動エネルギーの時空間マッピングは、分子内にあるトリプトファン残基のアンチストークスラマン散乱を検出して行う。アンチストークスラマン散乱は振動励起した分子のみから発生するため、その散乱光強度から直接タンパク質内部を移動するエネルギー分布を観測できる。しかし、発生する散乱光強度が微弱であるため、高感度検出を行うために本研究を実施する基盤として安定な光源を持つ分光システムが必要である。このため、既存のレーザー分光システムに新たに波長変換装置を導入し、ヘムを光励起する可視光（400~600 nm）、およびトリプトファン残基の共鳴ラマン散乱を検出する紫外光（220~240 nm）のピコ秒パルスを安定に得ることができるようになった。これをもちいて、高感度なピコ秒時間分解紫外共鳴アンチストークスラマン分光システムを開発した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本年度に導入した光パラメトリック発振増幅器は、安定な出力でヘムの光励起を行う可視光およびトリプトファン残基のアンチストークスラマン散乱を観測する紫外光を、それぞれ独立にチューニングすることができる。これにより、高効率でヘムに余剰振動エネルギーを発生させ、高感度にトリプトファンのアンチストークスラマンスペクトルを観測できるようになった。このように、分光システムの完成により本研究課題を推進する基盤が整った。
Strategy for Future Research Activity	光励起によりヘムで発生した余剰振動エネルギーのタンパク質分子内時空間マップを行うために、構造既知の天然タンパク質を鋳型にした改変タンパク質を作製し、振動エネルギー移動のプローブとなるトリプトファン残基を異なる位置に1残基ずつ持つ改変タンパク質を作製し、時間分解アンチストークスラマン散乱を観測する。トリプトファン残基の系統的な位置依存性を、タンパク質の特徴的な構造（αヘリックス：ヘム－トリプトファン残基間の方向は一定で距離を等間隔に変更できる、βシート：ヘム－トリプトファン残基間の距離は一定で方向を変更できる）を利用して調べ、タンパク質分子内熱伝導機構を解明する。