2020 Fiscal Year Annual Research Report
助細胞から胚への細胞運命転換の誘導を通じた多胚性種子の研究
| Project Area | Remodeling Plant Reproduction System by Cell Fate Manipulations. |
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| Project/Area Number |
20H05781
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
丸山 大輔 横浜市立大学, 木原生物学研究所, 助教 (80724111)
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| Project Period (FY) |
2020-10-02 – 2023-03-31
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| Keywords | 多胚種子 / 助細胞胚乳融合 / プログラム細胞死 / アポミクシス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
被子植物の卵細胞の隣には、花粉管の誘引を担う助細胞が存在する。シロイヌナズナでは受精後に発達する種子の中で、役目を終えた助細胞は胚乳と細胞融合することで消滅する（助細胞胚乳融合）。ところが、われわれが分離した助細胞の細胞融合が起こらないシロイヌナズナのctl17変異体では、発達中の種子にある助細胞が胚のそばで伸長していた。本研究では受精後のプログラム細胞死の過程を阻害し、かつ胚形成遺伝子を過剰発現されることで、助細胞が胚へと細胞運命転換して多胚種子が得られるのではないかと考えた。
2020年度に計画していた多胚種子作製に向けたシロイヌナズナ変異株の準備は新型コロナウイルスによって、遅延が生じたものの、2021年度中に目的通りの植物系統を作出することができた。また、助細胞胚乳融合の鍵因子であるCTL17を未受精の胚珠の助細胞や卵細胞で発現させた異所発現実験の成果も得られた。これらについて2021年、日本動物学会第91回大会のシンポジウムや、日本分子生物学会第44回年会のシンポジウムにて発表した。
実験に用いる変異体の整備については特に、助細胞核崩壊に必要なエチレンシグナルを欠損するein2変異とctl17変異をともにもつ二重変異体の作出できたことが大きいが、いまのところ、この植物で受精後の種子における助細胞の発達促進効果は観察されていない。また、ein2 ctl17二重変異体については、体細胞胚形成遺伝子であるRKD1を助細胞で異所発現させる遺伝子を導入し、ヘテロ接合体を得た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ein2 ctl17二重変異体が作製が完了し、発達種子中の助細胞の形態を観察したところ、この二重変異体はctl17単独変異体よりも助細胞核の崩壊が抑制されているものの、多胚種子の出現には至らなかった。2021年度ではein2と同様に助細胞核崩壊を抑制されることが報告されているein3 eil1二重変異をもつ助細胞胚乳融合欠損株、ein3 eil1 ctl17三重変異も得られたので、今後、プログラム細胞死を抑制した助細胞の形態変化を詳細に調べる基盤ができた。
ein2 ctl17二重変異体に対して、体細胞胚を誘導する活性をもつRKD1を助細胞特異的に発現する遺伝子、pMYB98::RKD1-mNeonGreenを導入した植物を作製した。T1世代において導入した遺伝子をヘテロにもつ植物の種子発達を観察したところ、助細胞が細胞分裂を繰り返したような形態は見られなかった。また、いずれもein2 ctl17二重変異体でみられたような、肥大した細胞壁の薄い助細胞のみが観察された。導入遺伝子をホモ接合にした定量解析が待たれるものの、おそらく、プログラム細胞死を抑制した助細胞でRKD1を発現させるだけでは助細胞由来の胚をもつシロイヌナズナ多胚種子を作出することが困難であることが示唆された。
研究計画ではein2 ctl17 pMYB98::RKD1-mNeonGreenの定量解析を完了する予定であったので、進捗はやや遅れていると判断した。
その一方で未受精の胚珠の助細胞や中央細胞においてCTL17を異所発現させると、中央細胞と助細胞の融合を十分に引き起こす活性を持つことが判明した。CTL17は受精後に胚乳において発現上昇することを考えると、助細胞胚乳融合の開始の誘導においてCTL17が重要な機能を果たしていることが示された。
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| Strategy for Future Research Activity |
野生株，ctl17単独変異体，ein2単独変異体，ctl17 ein2二重変異体、そしてpMYB98::RKD1-mNeonGreenを導入したctl17 ein2二重変異体について ，種子発達に伴う助細胞の形態変化を観察する。具体的には、細胞伸長変化の時系列データや助細胞核の崩壊率を解析する。また、ctl17 ein2二重変異体作製の過程で、予想外にもein2変異体が助細胞胚乳融合率の低下するような結果も得られたので、ein2単独欠損やein3 eil1二重欠損によって助細胞胚乳融合率がどのような影響を受けるのか、定量的に解析する。また，現時点において助細胞を胚のように改変する試みが成功していない理由についての知見を得るため、細胞単離実験を遂行できる条件が整った場合は、受精後の助細胞における遺伝子発現をRNAseqにより解析する。
その一方で、異所発現によって明らかとなったCTL17の細胞融合活性については、今後の助細胞の研究においても重要な知見となりうるため、CTL17の詳細な機能解析を継続する。具体的には、CTL17のアミノ酸配列のなかでも保存された領域に点置換変異を導入した変異体を発現する遺伝子を作製し、その細胞融合活性を解析する。また、タンパク質分解系におけるE3ユビキチンリガーゼであるCTL17の気質タンパク質の同定に向けて、生化学的に相互作用するタンパク質を検出するためのプラスミド構築などを進める。
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