2021 Fiscal Year Annual Research Report
Visualization of interglial signal transduction
| Project Area | Glia decoding: deciphering information critical for brain-body interactions |
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| Project/Area Number |
20H05898
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
松田 道行 京都大学, 生命科学研究科, 教授 (10199812)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
隅山 健太 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, チームリーダー (00370114)
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| Project Period (FY) |
2020-11-19 – 2025-03-31
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| Keywords | 細胞間情報伝達 / FRETバイオセンサー / ERK / マップキナーゼ / グリア |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2021年度導入したアストロサイト特異的Cre発現マウスGlast-CreERおよびミクログリア特異的CRE発現マウスCx3Cr1-CreERをERKおよびPKAのFRETバイオセンサーのfloxマウスと交配させ、タモキシフェンによる誘導を行った。しかし、いずれもFRETバイオセンサーの発現を多光子顕微鏡下で観察することができなかった。そこで、CREによる組換えが起きていない可能性を考えて、免疫組織化学染色で発現を確認したところ、わずかながら発現が観察できた。このことは、現在使っているfloxマウスのプロモーターでは、十分なFRETバイオセンサーの発現ができないことを意味している。そこで、floxマウスを使う系を断念し、組織特異的プロモーターを有するAAVウイルスでプローブを発現させることとした。脳血液関門を透過できるPHP.eBを血清型プロモープロモーター的GfABC1Dをプロモータに持つAAVを作成し、グリア特異的発現を確認した。また、より深部のイメージングを可能とするために、Cre依存性にPhycocyanobilin (PCB)を発現するトランスジェニックマウスの作成を行った。PCBはiRFPに結合すると、Biliverdinに結合しているiRFPよりも格段に明るくなることが培養細胞で知られているからである。PCB発現マウスのバッククロスを行いシンジェニックにしたあと、Creの誘導を行って、PCBを発現するマウスの作成に成功した。さらに、国立循環器病センターに導入された多光子顕微鏡を使って、1 mmを超える深さの脳の観察ができる系を確立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
CRE依存性にマウス脳に発現させたFRETバイオセンサーが想定外に暗く、多光子顕微鏡でのイメージングができなかった。そこで、急遽、AAVを用いた遺伝子導入法に変更することにしたため、実験がやや遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
血液脳関門を透過できるAAVの利用の目途が立ったため、上記の実験の遅れは十分取り戻せる。また、PCB発現によりより深部でのイメージングが可能とわかったため、その技術開発に注力する。
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Research Products
(12 results)
