2021 Fiscal Year Annual Research Report
Neuronal circuit dynamics for memory state transition
| Project Area | Census-based biomechanism of circuit construction and transition for adaptive brain functions |
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| Project/Area Number |
21H05243
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
佐々木 拓哉 東北大学, 薬学研究科, 教授 (70741031)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
船水 章大 東京大学, 定量生命科学研究所, 講師 (20724397)
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| Project Period (FY) |
2021-09-10 – 2026-03-31
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| Keywords | 電気生理計測 / 遺伝子発現 / エレクトロポレーション / マウス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
脳の機能は、多様な生理学的・形態学的・遺伝学的性質を有する脳神経細胞によって実現されている。しかしながら、多くの場合、これらの性質の解析は独立した学問分野で行われてきたため、実際に行動中に表れる神経細胞の発火特性と遺伝子発現の関連付けはほとんどなされていない。本学術変革領域の目標の1つは、適応行動を司る神経細胞が実際にどのように神経活動を生じて、これらが多様な遺伝子発現パターンと関連するか明らかにすることである。このためには、in vivo条件で成体マウス脳から発火活動を記録した神経細胞を同定し、その細胞選択的に遺伝子発現解析を適用できる手法が必要となる。そこで本研究では、この技術的課題を克服し、動物行動時に記録した脳神経細胞からの遺伝子発現解析法の開発を目的とした。今年度は、in vivoでの神経細胞の生理学的性質と分子生物学性質を関連付けうる手法を開発することに成功した。近年類似した手法はいくつか報告されているが、既報の手法ではいずれもCa2+イメージング法により生理学記録を行うものであった。したがって、フレームレートにより発火活動記録の時間解像度が数十msオーダーで制限され、約2 msで生じる個々の発火活動を捉えられておらず、また、一部の手法では多重染色FISH法による遺伝子発現解析を行うことから、検出できる遺伝子数が数十遺伝子に限られていた。本手法は、ガラス電極による電気生理記録法を用いることで、0.05 msの時間解像度で記録し神経細胞の発火活動1つ1つを捉えることを可能とした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
成体マウスにおいて、in vivo条件で発火活動を記録しその神経細胞の遺伝子発現を解析するためには、発火活動を記録した神経細胞のみを標識し、さらに細胞内の遺伝子を回収する技術が必要である。本研究では、ガラス電極を用いたin vivo傍細胞記録法（juxtacellular記録法）と、単一細胞遺伝子発現解析法に着目し、（i）in vivo条件においてjuxtacellular記録法により単一細胞の発火活動を記録、（ii）記録終了直後、ガラス電極内に充填した色素を記録細胞に電気パルスにより導入、（iii）電極を引き抜いたのち、脳を取り出し急性切片を作成、（iv）切片上から色素標識された細胞を回収、（v）遺伝子発現解析、という実験行程を着想した。まず、記録細胞を可視化できる条件の検討を行い、電極抵抗と記録されるシグナルを基に海馬CA1錐体細胞から最大30分の電気生理記録を行ったのち、電気穿孔法により電極内の色素を記録細胞に導入した。記録終了後、電極を引き上げ、急性条件で脳切片を作成した。これにより、記録細胞のみを遺伝子を回収可能な条件で可視化できた。さらに各ステップでの条件を検討した結果、蛍光低分子化合物であるAlexa 594 hydrazideを500マイクロM以上の濃度で電極内液に添加し、2－10 nA/1 Hz/500 ms pulseの最適条件で刺激、200マイクロメートル厚で急性切片を作成することで成功率が上昇した。これまでに10細胞中8細胞の回収に成功し、1つの抑制性神経細胞群と2つの興奮性神経細胞群に分類することに成功した。解剖学的に抑制性神経細胞と判断できた2細胞が抑制性神経細胞群に分類されたことからも、本手法による遺伝子発現解析が妥当であることが示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの生理学研究により、個体の行動に応じた性質をもつ神経細胞群が多数報告されてきたが、実験的な制限によりその分子生物学的知見はほとんど存在しなかった。今後、Juxtacellular記録法を自由行動下に適用した知見に基づき本手法を発展させることで、本手法が個体の行動と神経細胞による情報処理、またその分子機構を関連づける有用な手法となり、本学術変革領域への貢献が期待される。より具体的な課題としては、本研究の条件検討は麻酔及び頭部固定下で海馬を対象として行われた。しかし、今回利用したin vivo juxtacellular記録法では、体性感覚皮質や聴覚皮質、視床網様核、大脳基底核黒質などの多様な領域から記録できることが報告されている。また、自由行動下での記録も報告されている。特に自由行動中の記録が出来れば、海馬の場所細胞をはじめとした、行動の自由度の高い実験系に適用できるため、汎用性が非常に高まると期待される。頭部固定や揺れの軽減など、詳細な条件検討を繰り返すことで、実現させたいと考える。さらに、本実験系では、記録する神経細胞の活動を光遺伝学的に操作できることや、局所的に薬剤を投与することで薬理学的な応答を観察できることも報告されている。これらは単純な細胞の計測だけでなく、操作を可能にすることで、様々な細胞応答を調べるための有用なツールになることが期待される。以上、実験法のさらなる改良と条件検討は必要であるが、多様な行動課題と実験条件を多様な脳領域において適用できる汎用性の高い手法とするために研究を進める予定である。
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