2021 Fiscal Year Annual Research Report
Structural Analysis of Non Domain Biopolymer
| Project Area | Biology of Non-domain Biopolymer |
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| Project/Area Number |
21H05281
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
伊藤 拓宏 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, チームリーダー (70401164)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
西増 弘志 東京大学, 先端科学技術研究センター, 教授 (00467044)
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| Project Period (FY) |
2021-09-10 – 2026-03-31
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| Keywords | 立体構造 / クライオ電子顕微鏡 / トモグラフィー / 単粒子解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
伊藤は非ドメイン型バイオポリマーが形成する非膜オルガネラの内部構造などを構造生物学の視点から明らかにすることを目指している。本年度はクライオFIB-SEM装置を用いて真核生物由来の凍結ラメラを調製し、それを用いてクライオTEMによるクライオ電子トモグラフィー測定を行い、高分解能情報を持つトモグラムを再構成できることを確認した。それと同時に細胞内ストレス応答の一つである統合的外レス応答を抑えるウイルス由来NSsタンパク質とeIF2Bとの複合体の立体構造を決定し、生化学的解析や培養細胞による解析と共にその作用機序を明らかにした。
CRISPR-Cas獲得免疫機構に関与するCas7-11タンパク質は4つのCas7ドメインと1つのCas11ドメインからなり、ガイドRNAと相補的な1本鎖RNAを配列特異的に2か所で切断する新規のRNA依存性RNA切断酵素である。Cas7-11は特異性が高く細胞毒性の低いRNA切断ツールとして期待されている。しかし、Cas7-11の立体構造は不明であった。西増は、クライオ電子顕微鏡単粒子解析により、Cas7-11-ガイドRNA-標的RNA複合体の立体構造を決定した。その結果、Cas7-11は4つのCas7ドメイン（Cas7.1-Cas7.4）、Cas11ドメイン、INSドメイン、CTEドメインが4つのリンカー領域（L1-L4）で連結した構造をもつことが明らかになった。ガイドRNAの5’タグ領域はCas7.1とCas7.2によって認識されており、スペーサー領域は標的RNAと対合し、Cas7.2-Cas7.4、Cas11、INSによって認識されていた。このような構造機能解析の結果、Cas7-11によるRNA依存性RNA切断の分子メカニズムが明らかになった。さらに、立体構造情報を基に小型のCas7-11改変体（Cas7-11S）の開発に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
伊藤による細胞内構造解析は着実に前進している。西増による真正細菌の獲得免疫機構の機能解析についても新規の機構を明らかにするなど、着実に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
伊藤はクライオ電子トモグラフィーに関する技術を向上させ、細胞内立体構造解析を目指す。具体的には、非膜オルガネラのマーカー蛋白質にGFPが付加されている細胞株を培養し、GFPシグナルを指標に目標を含んだ凍結薄膜をクライオFIB-SEM装置により作成する。作成した凍結薄膜をクライオTEM装置によりクライオ電子トモグラフィー測定を行う。3次元構造トモグラムを再構成し、それに応じてさらなる解析のための手法を検討し、非膜オルガネラ内の立体構造情報を獲得することを目指す。
III-E型CRISPR-Cas免疫機構に関与するCas7-11タンパク質はガイドRNAと複合体を形成し、標的となる1本鎖RNAを切断するRNA依存性RNA切断酵素（ヌクレアーゼ）として機能する。さらに、Cas7-11はCsx29タンパク質と複合体を形成することが報告されていたが、Csx29の機能は不明だった。西増はCas7-11－ガイドRNA－Csx29複合体におけるCsx29の役割について、立体構造解析と機能解析により明らかにすることを目指す。
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