2013 Fiscal Year Annual Research Report
ズームイン（高精細）とズームアウト（広視野・深部）観察を可能にする革新技術の開発
| Project Area | Mutli-dimensional fluorescence live imaging of cellular function and molecular activity |
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| Project/Area Number |
22113003
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
宮脇 敦史 独立行政法人理化学研究所, 脳科学総合研究センター, チームリーダー (80251445)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
濱 裕 独立行政法人理化学研究所, 脳科学総合研究センター, 専門職研究員 (30261796)
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| Project Period (FY) |
2010-06-23 – 2015-03-31
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| Keywords | イメージング / 蛍光蛋白質 / 細胞周期 / FRET / レチノイン酸 |
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| Research Abstract |
ニホンウナギの筋肉から緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を単離した。その遺伝子産物「UnaG」は、クラゲやサンゴ由来の蛍光タンパク質とはまったく異なるしくみで光ることがわかった。UnaGにおいてはビリルビンが特異的に結合し蛍光性発色団として働くのである。ビリルビンは、赤血球に含まれる酸素運搬タンパク質ヘモグロビンの代謝中間産物である。血清中のビリルビンの量が異常に増えると組織に沈着し黄疸症状が表れる。血清ビリルビン濃度は、溶血や肝臓機能を評価する指標で、一般的な健康診断の生化学検査項目に含まれ、また新生児黄疸を診断するうえでも必須の測定値である。ところが、1916年にジアゾ化法が開発されて以来いくつかのビリルビン比色法が開発されているが、いずれも複雑、感度が低い、特異性が低い、時間がかかるなどの問題があった。一方、UnaGを利用する蛍光測定法は簡単迅速に測定ができ、従来の比色法に比べ3桁以上の高感度、２桁以上の高精度の定量法を達成することがわかった。
細胞周期プローブFucciを恒常的に発現するトランスジェニックマウスを用いた解析を行った。まず#474/610ラインの血球系細胞の細胞周期進行を詳細に調べたところ、G0期とG1期とが、Fucciの赤色蛍光の強度によって識別できることがわかった。特にリンパ球が休止期状態と活性化状態との間を往復する様子を観察することができた。また、#474/610ラインから調製した造血幹細胞画分及び胎盤形成細胞画分を、独自に開発した細胞培養皿に撒いて長期間タイムラプスイメージングを施行した結果、細胞分化とendoreplication（細胞質分裂をスキップして核DNA量が指数関数的に増大する現象）との連関を観察することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
従来の蛍光タンパク質は、GFPやGFP-like proteinに代表されるように、タンパク質自身のペプチド部分を材料に発色団が形成されるものであった。我々が開発したUnaGは、ビリルビンをリガンドとして取り込んで蛍光性を獲得するタンパク質である。天然の色素をリガンドとして取り込む蛍光タンパク質はこれまでにもいくつか報告されているが、UnaGは様々な点で新奇のものと言える。ヘム代謝の中間産物のビリルビンを非共有結合的に取り込む特徴を利用して、蛍光性のビリルビンセンサーを開発することができた。臨床化学や小児科学の研究者や企業からの引き合いが多く、UnaGの医療分野での実用的な応用研究が始まっている。さらに、絶滅危惧種に近いニホンウナギにおけるUnaGの役割の探究など、非常に学際的な新学術領域研究に発展することが期待される。蛍光タンパク質の枠組みを大きく拡張しつつあるという観点で達成度は大きいと思われる。
Fucciのトランスジェニックマウスにおいて、赤蛍光は細胞分化を緑蛍光は細胞増殖を示すと言える。Fucciマウスを解析することにより、個体レベルで細胞周期の制御機構に関する情報を得ることができる。さらに、こうした研究に固定組織透明化技術Scaleを組み合わせることで、細胞の増殖と分化に関する大規模かつ高精細な３次元再構築モデルを作成することができるようになった。ズームインとズームアウトの両アプローチを提案する当研究領域の目標が達成されつつあると思われる。
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| Strategy for Future Research Activity |
生体イメージングの未開拓部分を開拓していく方策である。たとえばヘム代謝産物としてのビリルビン。人類は血清中のビリルビンを測定してきたが、血管外組織におけるビリルビンの濃度についてはまったく知らない。UnaGの変異体を作製し、哺乳類動物のビリルビン動態をイメージングすることを狙う。黄疸の原因物質として悪玉とみなされてきたビリルビンであるが、最近では善玉（抗酸化物質）として注目されつつある。我々の体を健康にするメカニズムを解明する研究として発展させていきたい。
また、生体イメージングの多角化を図っていく方策である。細胞周期、レチノイン酸、ビタミンＤ，カルシウム、酸化ストレス、オートファジーなどの動態を同時に観察するための遺伝子改変動物、光学顕微鏡、解析ソフトの開発を行っていく。
さらに、生体イメージングの課題である「深部アクセス」を向上させる技術開発を行う。プローブの長波長シフトなどを精力的に進める。
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