2012 Fiscal Year Annual Research Report
X-ray crystallography of molecular complexes regulating vesicular trafficking
| Project Area | Structural basis of cell-signalling complexes mediating signal perception, transduction and responses |
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| Project/Area Number |
22121003
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
深井 周也 東京大学, 放射光連携研究機構, 准教授 (10361792)
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| Project Period (FY) |
2010-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 分子認識 / シグナル伝達 / タンパク質複合体 / X線結晶構造解析 / 構造生物学 / 小胞輸送 / 低分子量GTPase |
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| Outline of Annual Research Achievements |
小胞輸送によるタンパク質や脂質の適切かつ正確な配置は，細胞の運動や形態変化，極性の形成などの「細胞の形と機能」に関わる多くのプロセスにおいて決定的に重要な役割を果たす．本研究では，「細胞の形と機能」の獲得において重要な役割を担う小胞輸送の制御に関わる分子複合体群のX線結晶構造解析を行い，複雑かつ精密に制御された複合体構築の原理と機能メカニズムの解明を通して小胞輸送制御のメカニズムを原子の精度で明らかにすることを目的とする．今年度は，低分子量GTPase Rabを対応する細胞小器官の膜に固定する役割を担う膜タンパク質GDFについて，高分解能結晶を作製することを目的として，特異的に結合する抗体のFab断片とGDFとの複合体との結晶化を試みたが，結晶を得ることができなかった．また，二重にゲラニルゲラニル化されたRabの調製を試みたが，合成効率の低下により結晶化スクリーニングまでに至らなかった．SNAREタンパク質を小胞体膜に挿入するGET複合体では，GET1の細胞質領域とGET3との複合体の結晶構造と変異体解析の結果から，GET1がGET3二量体の開状態を安定化することを示した．また，GET3とTAタンパク質との複合体の結晶化を試みたが，結晶化の際にTAタンパク質が解離してしまうことが示唆されたため，部位特異的クロスリンクによる複合体安定化の検討を開始した．昨年度，3.4 A分解能で構造決定を行ったM-Sec（膜融合の特異性と高効率性を保証するExocyst複合体のSec6サブユニットのホモログ）は，PIP2との結合とその細胞での役割を明らかにするための機能解析を進め，論文を準備中である．Exocyst複合体全体については，共発現系を構築して発現・精製の検討を行った．さらに，構造未知であるSec10サブユニットの予備的な結晶化に成功した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
GDFタンパク質の研究では，高分解能結晶の作製を目的として，特異的モノクローナル抗体を複数作成し，そのFab断片との共結晶化のスクリーニングを行った．また，GDFとより強く結合すると考えられる二重にプレニル化したRabの調製を開始した．GET複合体の研究では，GET3サブユニットとGET1受容体の細胞質ドメインとの複合体の結晶構造を決定し，立体構造に基づいて設計した変異体を用いた機能解析の結果とあわせてGET1がGET3二量体の開状態を安定化することを明らかにした．GET3と基質TAタンパク質との複合体の共結晶化は，複合体の解離が問題となっているが，部位特異的クロスリンクによって安定で形の一定な複合体が得られるものと期待している．Exocyst複合体の研究では，Sec6ホモログの構造解析と機能解析を終え，論文として発表する段階に至った．また，これまで結晶化が困難であったSec10サブユニットの予備的な結晶化に成功した．Exocyst複合体全体の共発現系を構築し，発現・精製の検討を開始することができた．
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| Strategy for Future Research Activity |
GDFタンパク質の研究は，単体の高分解能結晶の作成と脂質修飾Rabとの共結晶化に向けて進展しているので，このまま研究を進める．蛍光ヌクレオチドを用いてGDF活性をリアルタイムでモニターできるようになったので，活性を指標にした結晶化サンプルの再検討を行う．GET複合体の研究は，GET3と基質TAタンパク質との複合体の共結晶化に向けて，部位特異的クロスリンクによって，安定で形の一定な複合体の調製を進める．安定な複合体が得られれば，さらにGET1/2との複合体の調製・結晶化を進める．Exocyst複合体の研究では，複合体全体の発現ベクターを構築したが，発現・精製に関して検討の余地がある．また，サブユニット全体や一部を削ったような複合体を調製し，構造解析により適する性質の複合体を探索する．予備的な結晶が得られているSec10サブユニットについては，結晶の改善をすすめて構造解析へと向かうとともに，他の構造未知のサブユニットについても結晶化を試みる．また，引き続き研究領域内での共同研究も推進していく．
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[Journal Article] Molecular basis of K63-linked polyubiquitination inhibition by the interaction between human deubiquitinating enzyme OTUB1 and ubiquitin-conjugating enzyme UBC132012
Author(s)
Sato, Y., Yamagata, A., Goto-Ito S., Kubota, K., Miyamoto, R., Nakada, S,, Fukai, S.
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Journal Title
The Journal of Biological Chemistry
Volume: 287
Pages: 25860-25868
DOI
Peer Reviewed
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