2012 Fiscal Year Annual Research Report
シリア・中心体系を介する情報フローによる体の左右の決定
| Project Area | Cilium-centrosome system regulating biosignal flows |
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| Project/Area Number |
24113004
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
濱田 博司 大阪大学, 生命機能研究科, 教授 (00208589)
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| Project Period (FY) |
2012-06-28 – 2017-03-31
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| Keywords | 発現制御 / 発生・分化 / 左右非対称性 / 繊毛 / 水流 |
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| Research Abstract |
①ノード細胞へ前後の極性を与えている位置情報の実体：ノードの前後に沿って非対称に発現するWnt5a, 5bの役割と、Wntを介さない機構としてDchsの役割を調べる。Wnt5a/Wnt5b両者を欠損するマウス、過剰のWnt5aを均一に発現するマウス胚におけるノード繊毛の傾き（基底小体の位置）を調べる。Dchs1, 2の変異マウスを作成する。
②基底小体が細胞の後側へ移動する機構：ノード細胞において前後の極性を持って分布する細胞内極性タンパク質（Dvl, Pickleなど）の挙動を調べる。Prickle1, Prickle2の変異マウスを作成する。
③ノードのシリアが時計方向に回転する仕組み：異常な回転運動を示すinv変異マウスにおける、ノードシリアの超微細構造を観察する。
④アンテナの役割を持つシリアを介する細胞内シグナルの伝達機構：Ca2+チャネルPkd2）がシリアに局在する事が水流の感知に必要なので、シリアを経るCa2+シグナルを検出する。そのために、シリアに局在することが期待されるCa2+レポーター蛋白質（GCaMP）をデザインし、そのレポーターがノードで発現するトランスジェニックマウスを作成する。そして、Ca2+シグナルから標的遺伝子(Cerl2)の制御に至る経路を解明するために、Cerl2mRNAの3'UTRに結合するRNA結合性蛋白質を探索する。
⑤シリアを形成できないQilin変異マウスを糸口にして，ノード細胞の細胞周期に依存した基底小体・シリアの形成機構を明らかにする（稲垣との共同）：Qilin変異マウスから得たMEFなどを用いて、中心小体の複製における異常の有無を調べる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
①ノード細胞へ前後の極性を与えている位置情報の実体：Wnt5a/Wnt5b両者を欠損するマウス、過剰のWnt5aを均一に発現するマウス胚では、基底小体の位置が正しく決まらない事が判った。Dchs1, 2の変異マウスを作成した。
②基底小体が細胞の後側へ移動する機構：Prickle1, Prickle2の二重変異マウスでは、基底小体の位置がランダムになっていた。
③ノードのシリアが時計方向に回転する仕組み：異常な回転運動を示すinv変異マウスのノードシリアの超微細構造を観察した結果，微小管の走行に異常を認めた。
④アンテナの役割を持つシリアを介する細胞内シグナルの伝達機構：シリアを介して流入するCa2+を検出するために、シリアに局在するCa2+レポーター蛋白質（GCaMP）がノード繊毛で発現するトランスジェニックマウスを作成した。Cerl2mRNAの3'UTRに結合するRNA結合性蛋白質を探索した結果、幾つかの候補を得た。
⑤ノード細胞の細胞周期に依存した基底小体・シリアの形成機構を明らかにする（稲垣との共同）ために、Qilin/Cluap1変異マウスから得たMEFを調べた所、中心小体の複製異常を認めた。
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| Strategy for Future Research Activity |
①ノード細胞へ前後の極性を与えている位置情報の実体：Wnt5a,5b活性の抑制因子で、Wnt5a/5bとは逆にノードの頭側で発現する事が知られているSfrpの関与を検証する。Dchs1, 2の変異マウスにおける、基底小体の位置を調べる。
②基底小体が細胞の後側へ移動する機構：ノード細胞で働く細胞内極性タンパク質（Dvl, Pickle, Celsr1）の相互関係を明らかにする。例えば，各変異マウスにおいて残りの因子の局在の変化を調べる。
③ノードのシリアが時計方向に回転する仕組み：繊毛の運動性・運動様式を制御すると予想される因子について変異マウスを作成して、種々の組織の繊毛の運動を調べる。
④アンテナの役割を持つシリアを介する細胞内シグナルの伝達機構：Ca2+レポーター蛋白質（GCaMP）がノード繊毛で発現するトランスジェニックマウスを用いて、シリアから流入するCa2+を検出する。目的のCa2+シグナルか否かは、左右非対称性の有無、Ca2+チャネルへの依存性、水流への依存性等で確認する。Cerl2mRNAの3'UTRに結合するRNA結合性蛋白質の候補について，結合性を生化学的に検証するとともに，その役割を遺伝学的に検証する。
⑤ノード細胞の細胞周期に依存した基底小体・シリアの形成機構（稲垣との共同）：Qilin/Cluap1の細胞周期依存的な発現や、蛋白質の繊毛や中心小体への局在機構を調べる。また、Qilin/Cluap1に結合する因子を探索・同定する。
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[Journal Article] Pih1d3 is required for cytoplasmic preassembly of axonemal dynein in mouse sperm.2014
Author(s)
Dong, F., Shinohara, K., Nabeshima, R., Botilde, Y., Asai, Y., Fukumoto, A., Hasegawa, T., Matsuo, M., Takeda, H., Shiratori, H., Nakamura T., and Hamada, H.
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Journal Title
J. Cell Biol.
Volume: 204
Pages: 203-213
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Cluap1 localizes preferentially to the base and tip of cilia and is required for ciliogenesis in the mouse embryo2013
Author(s)
Botilde, Y., Yoshiba, S., Shinohara, K., Hasegawa, T., Nishimura, H., Shiratori, H. and Hamada, H.
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Journal Title
Dev. Biol.
Volume: 381
Pages: 203-212
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Cilia at the node of mouse embryos sense fluid flow for left-right determination via Pkd2.2012
Author(s)
Yoshiba, S., Shiratori, H., Kawasumi, A., Shinohara, K., Sasaki, G., Belo, J.A., Nonaka, S., Sasaki, H., Kuo, I., Ehrlich, B., Pennekamp, P., Dworniczak, B., and Hamada, H.
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Journal Title
Science
Volume: 338
Pages: 226-231
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Fluid flow and interlinked feedback loops establish left-right asymmetric decay of Cerl2 mRNA in the mouse embryo.2012
Author(s)
Nakamura, T., Saito, D., Kawasumi, A., Shinohara, K., Asai, Y., Takaoka, K., Dong, F., Takamatsu, A., Belo, J.A., Mochizuki, A., and Hamada, H.
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Journal Title
Nat. Communic.
Volume: 3
Pages: 1322
DOI
Peer Reviewed
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