2013 Fiscal Year Annual Research Report
精神疾患マイクロエンドフェノタイプとしての樹状突起スパインの解析
| Project Area | Unraveling micro-endophenotypes of psychiatric disorders at the molecular, cellular and circuit levels. |
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| Project/Area Number |
24116003
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
林 朗子(高木朗子) 東京大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (60415271)
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| Project Period (FY) |
2012-06-28 – 2017-03-31
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| Keywords | 精神疾患 / 樹状突起スパイン / 2光子励起顕微鏡 / Synaptic optogenetics |
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| Outline of Annual Research Achievements |
統合失調症モデルマウスである前頭野特異的DISC1ノックダウンマウスのin vivoスパインイメージングを行ったところ、マウスの思春期に相当する時期にスパインが過剰に除去され、シナプス密度が大きく減少することを見出した。スパイン減少を予防する薬剤は、統合失調症の関連症状の一つである感覚運動情報制御機能の障害に対しても治療効果を有した。このことはスパインというマイクロエンドフェノタイプが如何に異常行動に相関するかを示唆する事に成功したことを意味する（Hayashi-Takagi A et al, PNAS, 111, 6461-6, 2014）。
一方で、スパインと行動とのより直接的なエビデンスを得るため、スパイン形態を人為的に消去する新しい技術：Synaptic optogenetics（AS-PaRac1）の最適化を完了した。AS-PaRac1は長期増強が誘導されたシナプスだけを青色光で消去する性質があることが実験的に確認され、実際に学習後に青色光を照射すると既得学習を消去できるとことも明らかになった（特許申請準備中、論文改訂中）。この新技術をシナプスパソロジーとしての精神疾患モデルマウス研究に展開することは、病態理解への大きな推進力になると考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
DISCノックダウンの縦断的スパインイメージングおよび行動解析は予定通りを完全に遂行し、論文発表を行うことができた（Hayashi-Takagi A et al, PNAS, 111, 6461-6, 2014）。一方で、スパイン形態とその機能の一つの指標としてのカルシウムイメージング（GCaMP6f)を行うことでこの研究を発展させる準備が進行している。具体的には、従来型のConventinalなノックダウンではなく、ノックダウン（DISC1 shRNA)を神経形態マーカー、GCaMP6fと共にInducibleに前頭野に発現させる実験系の構築に取り掛かっている。
一方で、スパインを光遺伝学的に操作するSynaptic optogenetics法の開発に関しても、予定通り論文投稿後、順調に論文改訂実験を行い、新手法としての利点・欠点などのCharacterizationを進めており、近日中（H27年度前半）に再投稿できると思われる。
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| Strategy for Future Research Activity |
【1】疾患モデルマウスのスパイン形態・カルシウムイメージング
上記のInducible knockdown系（DISC1 shRNA, GCaMP6f, mRuby2）のスパースラベリングの最適化を行う。実験系が完成したのちには、病態進行に伴うスパイン形態の観察（スパインサイズ、密度）とともに、シナプスレベルおよびその細胞体レベルのカルシウムイメージングを行い、疾患モデルにおけるスパイン異常がどのように神経発火パターンに影響を与えるかを解析する。
【2】Synaptic optogenetics
脳のいくつかの領域の学習記憶現象に応用し、各脳領域の学習記憶の細胞・神経回路基盤を可視化定量化し操作するfunctional connectomeを確立する。この新規プローブを用いて、まず心的外傷後ストレス障害（PTSD）モデルの病態可視化に挑戦する。前頭野（mPFC）に形態マーカー（mClover）とシナプス前終末マーカー（mTurquoise-VAMP2）を、BLAにAS-PaRac1（mRuby標識）をAAVによって導入する。これらの導入遺伝子はDIO-CRE /loxP-sCREを用い、tamoxifen依存的に発現するようにする。AAV遺伝子導入したマウスに恐怖学習させた後に、SCALEなどの脳透明化技術を用いて記憶スパインと神経活性依存的に発現した形態マーカーとシナプス前終末マーカーの分布を二光子顕微鏡で観察する。記憶プローブや形態マーカーを導入する領域を変えることでHippからmPFC、BLAからCeAなどの別の投射経路の記憶スパイン形成を有無を確認する。恐怖条件付けに関わる記憶スパインとその投射元の全体像を明らかにする。心的外傷を受けたすべてのヒトがPT
SDを発症するわけではなく、むしろ一部の少数者であることが明らかになっており、このような脆弱群と疾患抵抗群は動物モデルでも確立している。本申請では両群間の記憶スパインの形成率・分布の関係を比較解析し、病態への寄与の大きい神経回路を特定する。特定後は、恐怖条件付け後に光照射を行い、恐怖記憶の消去を試みる。
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