2013 Fiscal Year Annual Research Report
| Project Area | Harmonized supramolecular machinery for motility and its diversity |
|---|
| Project/Area Number |
24117002
|
|---|
| Research Institution | Osaka City University |
|---|
Principal Investigator |
宮田 真人 大阪市立大学, 大学院理学研究科, 教授 (50209912)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2012-06-28 – 2017-03-31
|
| Keywords | 細胞運動 / 一分子計測 / 電子顕微鏡 / 構造生物学 / 微生物 / 寄生細菌 / 電子線クライオトモグラフィー |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
病原細菌‘マイコプラズマ’はその片側に滑走装置を形成し，ユニークなメカニズムで“滑走運動”する．本研究ではこれまでの実験結果から提案した運動メカニズムの作業仮説，「滑走装置は4種類の新規巨大タンパク質から形成されており，ユニークな細胞骨格構造により支えられている．滑走装置からは長さ50ナノメートルのやわらかい“あし”が多数つきだしている．ATPの加水分解により装置に動きが生じ，“あし”のタンパク質が宿主細胞表面などのシアル酸オリゴ糖をつかんだり，ひっぱったり，はなしたりして，滑走運動が起こる．」に沿った実験を行い，マイコプラズマの滑走運動を，“狭義のモータータンパク質”と同レベルにまで解明することを目標とする．最速種で淡水魚病原菌のMycoplasma mobile（モービレ）と，ヒトに肺炎の病原菌であるMycoplasma pneumoniae（ニューモニエ）について研究を行う．これらは共通のメカニズムで滑走すると考えられるが，滑走装置を構成するタンパク質の構造には共通点がない．本年度は，1. 滑走装置の三次元電子顕微鏡像解析，2. 滑走に必須なタンパク質の構造解析，3. “あし”動きの検出と解析，4. 遺伝子操作による滑走装置の構造解析，を行い，それぞれ次項に記載する結果を得た．
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究実績の概要にあげたそれぞれの項目を以下の様に展開した．1. 滑走装置の三次元電子顕微鏡像解析：モービレの“滑走装置”の単離に成功し，表面構造と内部構造のそれぞれに注目した形での構造解析を行った．電子線クライオトモグラフィー（ECT）を用いた解析を行い，モーター部分の詳細な構造とATP加水分解に伴う構造変化，モーターから菌体表面の“あし”へのつながり，各部分の正確な大きさなどを明らかにした．また，前年度に総括班と共にセットアップした“急速凍結レプリカ電子顕微鏡観察法”を用いて，菌体表面の鮮明な構造をとらえた．ニューモニエ滑走装置の内部構造についても，より解像度の高い像を得ることに成功した．2. 滑走に必須なタンパク質の構造解析：モービレにおいて装置内部と菌体表面をつなぐタンパク質を同定した．マイコプラズマ両種の，滑走に必須なタンパク質，計６種の組換えタンパク質発現，精製を行い，３種については詳細な構造解析に成功した．3. “あし”動きの検出と解析：モービレの滑走時の動きと発生する力を，ビーズ，蛍光ラベル，光ピンセットなどを組み合わせた系を用いることで詳細に解析し，ひとつの“あし”の動きと力発生を捉えることに成功した．また単一のシアル酸オリゴ糖（SO）をコートしたプラスチックアレイを用いることでSOの認識方法を明らかにした．4. 遺伝子操作による滑走装置の構造解析：前年度に開発したモービレにおける遺伝子操作の系を用いることで，７つの滑走タンパク質の存在位置を明らかにしつつある．
|
| Strategy for Future Research Activity |
研究実績の概要にあげたそれぞれの項目を以下の様に進展させる．1. 滑走装置の三次元電子顕微鏡像解析：あらゆる位置と角度について急速凍結レプリカ法による可視化を行い，滑走装置全体の立体像とその構造変化を明らかにして滑走運動メカニズムの本質に迫る．構造変化の解析については，ネガティブ染色電子顕微鏡法と高速原子間力顕微鏡（AFM）を併用する．2. 滑走に必須なタンパク質の構造解析：組換えタンパク質として得られた“あし”タンパク質のリガンドであるシアル酸オリゴ糖との結合活性を，光ピンセットと原子間力顕微鏡で引き続き解析する．また組換えタンパク質に変異を導入し，結合活性に必要な構造を調べる．現在行っている電子顕微鏡および結晶化による構造解析を完成する．3. “あし”動きの検出と解析： “あし”や滑走装置内部構造を遺伝子操作，抗体，電荷など様々な方法をもちいて，金粒子や蛍光で標識する．これらの標識を光学顕微鏡で追跡することで，滑走時における動きを可視化する．4. 遺伝子操作による滑走装置の構造解析：これまでに滑走装置に存在することが蛍光顕微鏡などで示されている約20種のタンパク質の滑走装置中における位置を，タンパク質やタグとの融合を用いて，電子顕微鏡像上で明らかにする．さらにこれまでモービレやニューモニエでは不可能とされている相同組み換え法を開発し，様々な変異を導入することで，可能性のあるメカニズムを検証する．
|
