2002 Fiscal Year Annual Research Report
ウシ肝臓のヒスチジノールデヒドロゲナーゼの精製およびその分子生物学的研究
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01F00320
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
小野寺 良次 宮崎大学, 農学部, 教授
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
シャイラ ワドウッド 宮崎大学, 農学部, 外国人特別研究員
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| Keywords | 牛の肝臓 / ヒスチジノールデヒドロゲナーゼの精製 / プロタミン+ポリエチレングリコール / Native PAGE / 阻害剤 / 活性化因子 / Km / Vmax |
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| Research Abstract |
本研究では、ウシの肝臓のヒスチジノールデヒドロゲナーゼ(HLDase)(ヒスチジン合成酵素)を精製して性質を明らかにし、HLDaseのアミノ酸配列を決定し、さらにその塩基配列からオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブとしてウシ肝臓のcDNAライブラリーからHLDase遺伝子をスクリーニングして、HLDase遺伝子の塩基配列を決定することを目的とした。本研究は、平成13年度に採択されたが、外国人特別研究員の都合により、平成13年10月23日から開始した。平成13年度は、ウシ肝臓のHLDaseの精製の第1段階として、粗酵素液の硫安分画により活性を示すタンパク質画分を分画する予定であったが、この第1段階で、他の酵素とは異なり、硫安分画をすると活性が現れなくなることがわかり、まず、その原因を究明した。原因は、硫酸アンモニウムの存在により、高速液体クロマトグラフィーで分析した場合にヒスチジンのピークが消失することであった。硫安分画に代わる有効な手段として、プロタミンとポリエチレングリコール(PEG)を用いることよりHLDase活性を示すタンパク質画分を分画することができた。すなわち、1%硫酸プロタミンを加えて遠心後の上清液に7-18%PEG沈殿画分を集めた。この処理により、HLDaseの比活性は3.2倍になった。また、この酵素は、-80℃に1週間保存すると約15%だけ活性が低下した。L-ヒスチジノールに対するこの酵素のKmおよびVmaxは1.43および0.23mMであった。また、NAD^+に対しては、1.0および0.72mMであった。この酵素活性は、Mn^<2+>により84%だけ活性が高まった。0.5mM Hg^<2+>は、この酵素活性を完全に阻害した。次に、7-18%PEG沈殿画分のNative PAGEを行った結果、HLDase活性を示すバンドが2本現れた。まもなく精製が終了する。
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[Publications] Shaila Wadud, R.Onodera +2: "In vitro catabolism of histidine by mixed rumen bacteria and protozoa"Current Microbiology. 42. 12-17 (2001)
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[Publications] Shaila Wadud, R.Onodera +2: "Studies on the possibility of histidine biosynthesis from histidinol, imidazolepyruvic acid, imidazoleacetic acid, and imidazolelactic acid by mixed ruminal bacteria, protozoa and their mixture in vitro"Applied Microbiology and Biotechnology. 55. 219-225 (2001)
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[Publications] Shaila Wadud, R.Onodera +1: "Synthesis of histidine in liver and kidney of cattle and swine"Animal Science Journal. 72. 253-256 (2001)
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[Publications] R.Onodera +2: "Is histidine an essential amino acid in ruminant animals?"Asian-Australasian Journal of Animal Science. 14, Special issue. 123-130 (2001)
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[Publications] Shaila Wadud, R.Onodera +1: "Method for determination of histidine in tissues by isocratic high-performance liquid chromatography and its application to the measurement of histidinol dehydrogenase activity in six cattle organs"Journal of Chromatography B. 767. 369-374 (2002)
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[Publications] R.Onodera: "Essentiality of histidine in ruminant and other animals including human beings"Asian-Australasian Journal of Animal Science. 15. 455-454 (2003)
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[Publications] 石橋晃 監修: "新編「動物栄養試験法」"養賢堂. 642 (2003)
