2002 Fiscal Year Annual Research Report
超機能金属タンパク質の作製とセンシングおよび光エネルギー変換素子への応用
Project/Area Number |
01J00398
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Research Institution | Kumamoto University |
Principal Investigator |
三重 安弘 熊本大学, 薬学部, 特別研究員(PD)
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Keywords | 機能修飾電極 / Superoxide dismutase (SOD) / "逆"同位体効果 / 再配列エネルギー / 光還元反応 / NADPH / 薄層分光電気化学測定 / マルチレドックス酵素 |
Research Abstract |
1.種々の機能修飾電極を用いて様々な起源のSuperoxide dismutase (SOD)の電気化学(酸化還元)応答を検討したところ、(1)どのSODもシステイン修飾電極上で最も良い応答を示した。また、他のチオール系分子修飾電極上では起源により応答が異なり、タンパク質と電極との相互作用が電子移動反応に重要であることが示された。(2)活性中心が同じ金属イオンでも起源により酸化還元電位が異なり(シークエンスホモロジーが高く結晶構造も類似しているにもかかわらず)、活性中心近傍のアミノ酸と金属イオンとの微妙な相互作用の違いが電位(活性)に反映されることが示唆された(投稿準備中)。(3)SOD分子は機能電極上に安定に吸着固定されていることがわかり、スーパーオキサイドセンサへの応用の可能性が示された。 2.活性中心近傍に水素結合ネットワークを持つ野生型ミオグロビン(Mb)の電子移動速度は重水中において、軽水中よりも10倍速くなり、大きな"逆"同位体効果を示すことを見出した。一方で、水素結合ネットワークを崩壊させた変異体Mbでは、電子移動速度における同位体効果は観測されなかった。これらの結果は、電子移動における活性中心近傍の水素結合ネットワークの再配列エネルギー変化の相違を反映していると推察された(投稿準備中)。 3.シトクロムc、シトクロムb-562およびミオグロビンの活性中心イオンを亜鉛に置換した3種の亜鉛ヘム蛋白質を作製し、これらを光増感剤としてNADP^+の光還元反応を検討したところ、いずれの場合も同様な還元反応効率を示し、この系ではタンパク質の構造の違いは反応速度に影響しないことがわかった。また光還元生成物を、NADPHを補酵素とするリンゴ酸酵素およびその基質と反応させたところリンゴ酸が生成し、光照射反応により生じた生成物は生体系で使用されているNADPHであることが確認された。 4.機能電極を用いた嫌気下での薄層分光電気化学測定システムを構築し、シトクロムb-562、ニトロフォリンなどのヘムタンパク質の酸化還元電位を評価できた。 5.酸化還元部位を複数もつ酵素(マルチレドックス酵素)を電極表面に固定化し、その触媒反応機構の解明およびセンンング素子へ応用することを目的として、大腸菌由来の膜蛋白質であるギ酸脱水素酵素の大量発現系の構築を行い、His-tag法を用いることで純度の高いサンプルを得ることに成功した。
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Research Products
(1 results)